上海恒遠生物近期總結免疫組化實驗中得出:經甲醛固定的部分組織細胞,因固定過程中可能會形成醛鍵或羧甲基而封閉(bì)部分抗原決定簇,使免疫組化标記敏感性明顯降低,因此在染色前,有些抗原需進行修複(fù)或暴露。
抗原修複方法可分爲化學方法和物理方法。化學方法是以酶消化方法,常用胰蛋白酶及胃蛋白酶,配制濃度與消化時間要适度。常用的物理方法有單純加熱、微波處理和高壓加熱。在選用這三種方法時,浸泡切片的緩沖(chōng)液的離子強度和pH、加熱的溫度和時間均影響著(zhe)抗原修複效果。
1、pH的應用範圍及選擇
抗原修複液的pH非常重要,有效的抗原修複pH要比修複液的化學成分更重要,同樣的修複液随著pH的升高染色的強度逐漸增強,但*pH範圍爲6.0-10.0。目前大家*的的抗原修複液是pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液和pH8.0的EDTA緩沖液。作爲通用修複液堿性pH的修複液要比酸性的有效,而對固定很長時間舊的存檔組織,酸性pH的修複液則優於堿性的修複液。
2、抗原修複時應選擇*溫度
70-90℃的溫度對未經固定的蛋白質可發生變性,但經福爾馬林固定的蛋白質,溫度必須達到92℃以上方能使其變性。研究結果顯示,溫度爲92-98℃是合适的,95℃效果。
3、抗原修複液必須遵循自然降溫規律,否則效果不好或達不到抗原修複的目的
抗原修複持續時間過後,取出放於室溫中讓其慢慢地降溫,不能爲瞭争取時間,強行用冰塊或冷水使其降溫。這是因爲當高溫中的抗原蛋白分子鏈脫離瞭其他的束縛或聯結,要有一個自然環境讓其自然放松下來,随著溫度的降低,它們會慢慢地恢複原來的形态和構型。
4、盡量使用足量的抗原修複液
應用於抗原修複的液體,一定要充足,防止切片幹涸。應用大量的抗原修複液時,由於它的量較大,可延緩液體的沸騰時間,增加切片受微波輻射的量,對抗原修複将達到*。
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