您現在的位置:首頁 > 技術文章 > ELISA固體樣本處理方法,您知道嗎?

ELISA固體樣本處理方法,您知道嗎?

  • 發布日期:2017-12-13      浏覽次數:2486
    • ELISA固體樣本處理方法:
         固體樣本處理原則:稱取1g的固體樣本,用9g的合适緩沖液溶解,分泌蛋白可以直接離心取上清檢測,細胞内的蛋白,要先收集細胞,再用合适方法破碎 ,離心取上清測試。
      1、組織标本:切割标本後,稱取1g組織 ,加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工或勻漿器将标本勻漿充分。離心20分鍾左右(2000-3000轉/分),仔細收集上清。分裝一份待檢測 ,其餘冷凍備用,保存過程中如有沉澱形成,應再次離心。對於植物組織,不好勻漿的話,就用液氮研磨,将植物組織放在研缽中,加入适量液氮,充分研磨 。
      2、細胞内蛋白樣本:
      許多待測蛋白不是分泌蛋白,而是存在於細胞内的蛋白 ,這個時候,要先收集細胞,洗滌幹淨,再破碎細胞,離心取上清。
      (1)培養的細胞
      A、動物細胞 :用PH7.2-7.4的PBS稀釋細胞懸液,使細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反複凍融(如果反複凍融,破碎效果不好,就採用超聲波破碎),以使細胞破壞並放出細胞内成份。2-8℃條件離心20分鍾左右(2000-3000轉/分),仔細收集上清,保存過程中如有沉澱形成,應再次離心。
      B、植物細胞:用PH7.2-7.4的PBS稀釋細胞懸液,使細胞濃度達到100萬/ml左右 ,置於冰盒上,用超聲破碎儀,設置破碎2s,冷卻30s的方式,充分破碎細胞,以使細胞破壞並放出細胞内成份。2-8℃條件離心20分鍾左右(2000-3000轉/分),仔細收集上清,保存過程中如有沉澱形成,應再次離心。
      (2)組織的細胞
      切割标本後 ,稱取1g組織,加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工或勻漿器将标本勻漿充分。2-8℃條件離心20分鍾左右(2000-3000轉/分),去除上清,再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗滌沉澱的細胞三遍。再用上述的細胞破碎方法破碎細胞。
      3、土壤:稱取1g土壤,加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工将标本充分混勻。2-8℃條件離心20分鍾左右(2000-3000轉/分),仔細收集上清 。分裝一份待檢測,其餘冷凍備用,保存過程中如有沉澱形成,應再次離心 。如果是測分泌蛋白,直接取上清檢測,測試細胞内蛋白,要破碎細胞。
      4、咽拭子:加入2g的pH7.2-7.4左右的PBS,溶解咽拭子頭部,搖勻,用鑷子取出咽拭子並擠幹液體,2-8℃條件離心20分鍾左右(2000-3000轉/分),仔細收集上清 。分裝一份待檢測,其餘冷凍備用,保存過程中如有沉澱形成,應再次離心。如果是測分泌蛋白,直接取上清檢測,測試細胞内蛋白,要破碎細胞。
      5. 植物标本的採集及保存 
      1、 稱取0.1g(誤差±3%以内)新鮮植物組織樣本,在液氮中充分研磨;
      2、 加入1ml的提取液(80%甲醇), 置於-20度過一夜;
      3、 於4度,8000rpm,離心1小時,取上清;
      4、 上清液過C-18固相萃取柱。具體步驟是: 80%甲醇(1ml)平衡柱→上樣→收集樣品→移開樣品後用100%甲醇(5ml)洗柱→100%yi醚(5ml)洗柱→100%甲醇(5ml)洗柱→循環。過柱後的樣本真空幹燥或氮氣吹幹,保存備用;
      5、 上樣前加入pH7.4 PBS緩沖液(1ml定容)。混勻後室溫放置30分鍾,然後4度離心(8000rpm,15分鍾),取上清並暫時保存於4度待用。

                          
      樣本收集注意事項:
      1、不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
      2、标本採集後盡快進行實驗,若不能馬上進行試驗,可将标本放於-20℃保存,但應避免反複凍融。
      3、以上的内容是通用的樣本處理方法,無法涵蓋各種樣本,對於一些特殊樣本,建議實驗人員多參考已發表的文獻,自行設計合理的樣本處理方法或者來電詳詢,恒遠将爲您安排技術專員進行指導。