細胞因子ELISA試劑盒實驗标準操作方法與常見問題

    ELISA實驗以靈敏度較高、特異性較好的特點在科研領域上得到瞭(le)廣泛的應用，但操作中的各個環節對試驗的檢測效果影響較大
，如不注意，有可能導緻顯色不全、花闆等結果。以下是恒遠小編爲大家收集的細胞因子ELISA試劑盒實驗标準操作方法與常見問題，希望對您有所幫(bāng)助！

               

一、标本的選擇與準備
    用於ELISA測定的科研标本zui爲常用的是血清(漿)，有時因爲特定的檢測目的，也用到唾液
、腦脊液、尿液、糞便等标本。目前科研上使用血清标本測定的标志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤标志物、激素、特種蛋白、細胞因子和治療藥物等。對用於激素和治療藥物測定的血清标本的收集，要注意收集時間甚或體位有可能會對測定結果産生影響。如可的松在早晨4～6點之間，會有一峰值出現：生長激素、促黃體激素(LH)和促卵泡激素(FSH)均以陣發性方式釋放，因此，在測定此類激素時，有必要在密切相連的時間間隔内採取數份血樣本，以其中間值爲測定值。又如當從卧位變爲站立位時，血清中腎素活性将出現明顯增高
。再如治療藥物的檢測，應根據藥代動力學選擇服藥後的zui适時間抽血檢測
。用於傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤标志物和特種蛋白等的檢測的血清标本的收集則沒有時間和體位方面的影響，隻是在處理和保存方面要考慮以下幾個方面：

(1)要注意避免出現嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP爲标記酶的ELISA測(cè)定中

，如血清标本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附於(yú)固相，從而與後面加入的HRP底物反應顯色。

(2)樣本的採(cǎi)集及血清分離中要注意盡量避免細菌污染
，一則細菌的生長，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白産生分解作用;二則一些細菌的内源性酶如大腸杆菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應酶作标記的測(cè)定方法産生非特異性幹擾。

(3)血清标本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周
，如爲有菌操作，則建議冰凍(dòng)保存。樣本的長(zhǎng)時間保存
，應在-70℃以下。

(4)冰凍保存的血清标本須注意避免因停電等造成的反複凍融。标本的反複凍融所産(chǎn)生的機械剪切力将對标本中的蛋白等分子産(chǎn)生破壞作用，從(cóng)而引起假陰性結果。此外，凍融标本的混勻亦應注意，不要進行劇烈振蕩，反複颠倒混勻即可。

(5)标本在保存中如出現細菌污染所緻的混濁或絮狀物時，應離心沉澱(diàn)後取上清檢測(cè)。

二、試劑的準備
    在科研實驗室，對試劑準備一般不太注意，通常的做法是，在實驗時将試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略瞭這種做法有可能影響後面溫育時間不夠的問題，其直接的後果是對一些弱陽性标本的檢測出現假陰性
。因此在ELISA測定中試劑的準備zui爲關鍵的是
，在實驗開始前，将試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置30-60分鍾，再進行測定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是爲瞭在後面的溫育反應步驟中，能使反應微孔内的溫度能較快地達到所要求的高度，以滿足測定要求。

三、加樣
（1） 标本爲血清
：将血液先自然存放1-2小時後，再用3000rmp離心15分鍾;标本爲血漿：必須使用含抗凝劑的血液标本收集管，採血後必須立即颠倒採血管混合5-10次，放置一段時間後，3000rpm離心15分鍾;若在幾天内檢測，可放在2-8℃冰箱中，若要貯存，則置於-20℃的低溫冰箱内。

（2）加樣後(hòu)及時(shí)放入孵箱。 

（3）加酶試劑後(hòu)用吸水紙在酶标闆表面輕拭吸幹(gàn)。

（4）如果採(cǎi)用AT或其他全自動加樣，選擇FAME或其他後處(chù)理儀器加酶試劑。 

（5）标本較(jiào)多時，請(qǐng)分批操作。

（6）血清樣本的加入幾乎是唯yi的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意的關鍵點是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和産(chǎn)生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準確(què)性和均一性。加在孔壁上部的非包被區，易導緻非特異吸附。濺出會對鄰近孔産(chǎn)生污染。出現氣泡則反應液界面有差異。

四、孵育
（1）溫育是ELISA測定中影響測定成敗zui爲關鍵的一個因素。ELISA作爲一種固相免疫測定，抗原抗體的結合反應在固相上進行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結合，必須在一定的溫度條件下反應一定的時間。溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。zui爲常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。按照操作說明嚴格控制孵育時間；

（2）孵育時貼封片或加蓋，避免标本或稀釋液蒸發(fā)，吸附於(yú)孔壁。

五、洗闆
    保證洗液注滿各孔，洗闆針暢通，洗完闆後在吸水紙(選擇幹淨、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍幹;反應闆過多時，合理安排，或多用幾台洗闆機，避免等待時間過長。

六、顯色
    顯色劑盡量在臨用前配制，堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍色的TMB顯

七、終止
    在加終止液時應避免産生氣泡，而導緻假陽性結果。

八、讀闆
    整個操作過程中保證酶标闆不接觸次氯酸;盡可能實現ELISA檢測标準自動化，有效提高檢測質量。
細胞因子ELISA試劑盒在實際操作中，除瞭選擇優良試劑外，必須嚴格按照操作步驟進行操作，同時作好室内質控、室間質評，以嚴謹的工作作風檢測每一份标本，才能保證檢測質量。

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