結合物即酶标記的抗體（或抗原），是ELISA中至關重要的關鍵的試劑。良好的結合物應該是既保有酶的催化活性，也保持瞭抗體（或抗原）的免疫活性。結合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當的分子比例，在結合試劑中應盡量不含有或少含有遊離的（未結合的）酶或遊離的抗體（或抗原）。此外 ，結合物尚要有良好的穩定性。
用於ELISA的酶應符合以下要求：
①純度高
②催化反應的轉化率高
③專一性強
④性質穩定
⑤來源豐富
⑥價格不貴
⑦制備成酶結合物後仍繼續保存它的活性部分和催化能力
⑧在受檢标本中不存在相同的酶
⑨相應底物易於制備和保存，價格低廉 ，有色産物易於測定等
在ELISA中 ，常用的酶爲辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。在少數商品ELISA試劑中，應用的酶尚有葡萄糖氧化酶 、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。國産(chǎn)ELISA試劑一般都用HRP制備(bèi)結合物。HRP是一種糖蛋白，含糖量約爲18%，分子量爲44000，是一種複合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成，是一種卟啉蛋白質。主酶無色糖蛋白在275nm波優點有高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵卟啉環 ，在403nm波優點有高吸收峰。HRP的純度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意爲純度數）表示，是403nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP的RZ≥7.0。
HRP除符合上述的ELISA中标記酶的要求外 ，更有價格低廉和性質較穩定的特點。值得留意的是 ，在選用酶制劑時，除其純度RZ外 ，更應留意酶的活力。高純度的酶如保存不當，活力也會降低 。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示，可用對底物作用後天生産(chǎn)物量的測(cè)定進行試驗。
國外很多ELISA試劑採(cǎi)用堿性磷酸酶（AP）作爲标記酶 。常用的AP有兩個來源，分别從大腸杆菌和小牛腸膜中提取。不同來源的酶生化特性特性略不相同，從大腸杆菌中提取的AP分子量爲80000，酶作用的适合pH爲8.0；用小牛腸膜中提取的AP分子量爲100000，适宜pH爲9.6。在ELISA中，AP系統的敏感度一般高於(yú)HRP系統，空缺值也較低，但AP價格昂貴 ，制備結合物所得率也較HRP低 。
制備(bèi)結合物時所用抗體一般 均爲純度較高的IgG，以免在與酶聯結時其他雜蛋白的幹擾。用親和層(céng)析純的抗體，這樣全部酶結合物均具有特異的免疫活性 ，可以在高稀釋度進行反應，實驗結果本底淺淡。如用F(ab)2進行标記，則更可避免标本中RF的幹擾。在ELISA中用酶标抗原的模式未幾，總的要求是抗原必須是高純度的。
用於(yú)稀釋高濃度的結合物以配成工作液。爲避免結合物在反應中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加進高濃度的無關蛋白質（例如1%牛血清白蛋白），通過競争以抑制結合物的吸附。一般還加進具有抑制蛋白質吸附於(yú)塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20，0.05%的濃度較爲适宜。在間接測(cè)定抗體時，血清标本需稀釋後進行測(cè)定，也可應用這種稀釋液。
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