ELISA具有敏感性高、特異性強、操作簡單等優點，被廣泛應用於(yú)各種抗原和抗體的測定，爲輔助臨床診斷與生物科研起到瞭(le)積極的推動作用 。但ELISA測定中影響因素較多，操作過程中每個環節都會對試驗結果産生影響 ，出現錯誤的結果。
試(shì)劑(jì)的因素
試劑的選擇：試劑的選擇是保證血液檢測(cè)質量的關鍵要素。雖然國家採(cǎi)用批批檢定的形式對ELISA試劑嚴格把關，但不同廠家的試劑在使用效果上仍存在在差異。要選購度相對高、具有“三證”的試劑，不要用無批号的試劑 ，選用與儀器配套的試劑。更不要使用過期的試劑和混用不同批号的試劑。
操作中的因素
加樣：孵育前加樣時間過長，酶試劑加出孔外，使用滴瓶滴加試劑時，滴加的角度不同和擠壓的力度不同，緻使滴加的試劑量不準，都可導緻試驗結果不準確 。
控制方法：
①實驗樣本過多時，可分批次操作，以減少實驗時間延長造成的誤差；
②加酶試劑後，用吸水紙吸幹孔外試劑；
③作定量試驗時，使用加樣器加注試劑，並經常校正其準確性，此外，要做到一份樣本一個移液頭，防止交叉污染。
溫育：溫育是ELISA測(cè)定爲關(guān)鍵、容易出現問題的步驟。爲常見的溫育溫度有37℃和室溫 ，其次是43℃和2-8℃。目前國内售ELISA試劑盒溫育時間爲37℃，30 min-1 h，進口ELISA試劑盒則通常爲37℃，1-2 h能有較*的結合。
溫育時間、溫度的選擇一般根據試劑盒的說明書選擇溫育的時間、溫度。加完樣本和（或）試劑後将微孔闆從室溫放入水浴箱或溫箱中時 ，孔内溫度從室溫升至37℃需要一定時間 ，如果是将微孔闆一放入溫箱即開始計時，這樣就容易造成實際測定中溫育時間不夠，易緻弱陽性标本測不出來。
控制方法 ：
①如有兩種溫度，盡量使用較低的溫育溫度、較長反應時間的條件；
②用1個小溫度計放置在闆孔反應液中測量觀察。
“邊緣效應”的排除“邊緣效應”是在使用96孔闆的ELISA測定中 ，外周孔顯色較中心孔深的現象。産生的原因可能是爲96孔闆周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學梯度造成的 ，因此在溫育時盡量採用水浴。
洗闆：ELISA測定的洗闆一般有兩種方式，即手工和洗闆機洗闆。採用手工洗闆，孔與孔之間液體易交叉，採用半自動洗闆機時，洗液量不足導緻洗闆不*，洗闆針堵塞導緻抽吸不*，洗闆不暢導緻清洗效果差。
控制方法：
①手工洗闆時，拍闆時要垂直，避免交叉污染，用力不能過猛，防止抗原抗體複合物脫離；
②洗闆機洗闆時應經常檢查沖洗頭是否通暢，若被雜物堵塞時可用注射器針頭挑出；
③爲瞭洗滌效果好，實驗室可採用機器與人工洗滌相結合的方法，在機器洗滌後再進行人工洗闆1-2次，或适當增加洗闆的次數，有資料報道洗闆7次能達到理想的洗滌效果。
顯色：市售ELISA試劑(jì)盒中，如以四甲基聯苯胺(TMB)爲底物，則提供的底物爲A和B兩瓶應用液；如以鄰苯二胺(OPD)爲底物，則試劑(jì)盒提供鄰苯二胺片劑(jì)或粉劑(jì)。顯色反應條件爲37℃或室溫反應15-30 min。以鄰苯二胺(OPD)爲底物的試劑(jì)，要臨用前30 min配制且必須避光。以四甲基聯苯胺(TMB)爲底物的試劑(jì)則不需避光，但A、B液應盡量避免接觸(chù)金屬器械。
結果判定：讀取結果要在15-30 min内完成，定性測(cè)定用肉眼判讀試驗結果時，反應闆應水平距離白色背景10-15 cm；定量測(cè)定時用酶标儀讀取結果，酶标儀不應置於(yú)陽光或強光照射下，需先預熱15-30 min再進行測(cè)試。
綜上所述，盡管ELISA法操作簡單，但可能影響測(cè)定結果的因素也較多。故在實際操作的過程中，要加強質量管理，認真避免或減少影響因素，力求結果準確(què)，爲疾病的診斷和科研提供可靠的依據。
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