細胞培養 ，看似簡單的一個實驗，卻不知道把多少英雄豪傑折磨的意欲“自挂東南枝”。今天恒遠生物就爲大家盤整理出瞭(le)一篇養細胞的注意事項，養細胞可不同於(yú)養閨女，稍微磕磕碰碰，一切就重新來過！希望廣大科研汪能與細胞愉快的玩耍呦！
（一）冷凍(dòng)管應(yīng)如何解凍(dòng)
取出冷凍(dòng)管後，須立即放入 37 ℃ 水槽中快速解凍(dòng)，輕搖冷凍(dòng)管使其在 1 分鍾内全部融化 ，並(bìng)注意水面不可超過冷凍(dòng)管蓋沿 ，否則易發生污染情形 。另冷凍(dòng)管由液氮桶中取出解凍(dòng)時 ，必須注意安全，預防冷凍(dòng)管的爆裂。
（二）細胞冷凍管解凍培養時，DMSO如何處理
在細胞解凍(dòng)之後，可直接離心去除DMSO，用新鮮的培養基懸浮後直接放入含有 新鮮培養基的培養角瓶中進行細胞培養，如此可避免解凍(dòng)後細胞生長(zhǎng)受到DMSO影響。
（三）可否使用與原先培養條件不同的培養基
每一細胞株均有其特定使用且已适應的細胞培養基，若驟然使用和原先提供培養條件不同的培養基，細胞大都無法立即适應，造成細胞無法存活 ，不應該(gāi)馬上替換(huàn)。
（四）可否使用與原先培養條件不同的血清種類
血清是細胞培養上一個極爲重要的營養來源 ，所以血清的種類和品質對於(yú)細胞的生長會産(chǎn)生影響。來自不同物種的血清，在一些物質或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。
（五）何謂 FBS，FCS，CS，HS
FBS （fetal bovine serum） 和 FCS （fetal calf serum） 是相同的意思，兩(liǎng)者都是指胎牛血清。CS （calf serum） 則是指小牛血清。HS （horseserum） 則是指馬(mǎ)血清。
（六）培養細胞時應使用 5% 或 10% CO2
一般培養基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作爲 pH 的緩沖系統，而培養基中 NaHCO3 的含量将決定細胞培養時應使用的 CO2 濃度。理論當培養基中 NaHCO3 含量爲每公升 3.7 g 時，細胞培養時應使用 10% CO2；當培養基中 NaHCO3 爲每公升 1.5 g 時 ，則應使用 5% CO2 培養細胞。
（七）何時須更換培養基。培養基中是否須添加抗生素。
視細胞生長(zhǎng)密度而定，或遵照細胞株基本數據上的更換(huàn)時間 ，按時更換(huàn)培養基即可。
一般正常培養狀态下 ，培養基中可以添加抗生素 。 按1％體積(jī)分數加入雙抗貯存液(青黴素+鏈(liàn)黴素)，使青黴素和鏈(liàn)黴素的終濃度分别爲100 U/mL和100 μ/mL。
(八）貼壁細胞傳代時所使用的trypsin-EDTA濃度及相應處理
一般使用的 trypsin-EDTA 濃度爲0.25%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。*開瓶後應立即少量分裝於(yú)無菌試管中，保存於(yú)–20 ℃，避免反複冷凍解凍造成trypsin的活性降低 ，並(bìng)可減少污染的機會。
（九）将一般動物細胞離心下來 ，離心速率多少
回收動(dòng)物細胞，其離心速率一般爲1000 rpm，5-10 分鍾，過(guò)高的轉速，将造成細胞死亡。
（十）細胞的接種密度
依照細胞株基本數據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可 。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長(zhǎng)的重要原因之一。
（十一）細胞冷凍培養基的成分及DMSO的等級
動物細胞冷凍保存時常使用的冷凍培養基是含 5-10% DMSO （dimethyl sulfoxide） 和 90~95 % 原來細胞生長(zhǎng)用的新鮮培養基均勻混合。注意 ：由於(yú) DMSO 稀釋時會放出大量熱能 ，故不可将 DMSO 直接加入細胞液中 ，必須使用前先行配制完成 。冷凍保存使用的 DMSO 等級，必須爲 Tissue culture grade 的 DMSO ，其本身即爲無菌狀況 ，首次開瓶後應立即少量分裝於無菌試管中避光保存。
（十二）冷凍保存細胞的方法及冷凍細胞濃度
将貼壁細胞消化後離心收集，懸浮細胞直接離心收集，以含有DMSO*培養基或胎牛血清的凍(dòng)存液重懸細胞至終濃度約1x106/ml。。以每管1～2ml分裝至凍(dòng)存管中 。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍(dòng)過(guò)夜。次日保存到液氮中。
冷凍(dòng)管内細胞數(shù)目一般爲 1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以 5x106 cells/ml vial 爲宜。
（十三）如何避免細胞污染
細胞污染的種類可分成細菌、真菌、黴菌、病毒等 。主要的污染原因爲無菌操作技術不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染的血清和污染的細胞等。嚴格無菌操作技術、清潔的環(huán)境、與品質良好的細胞來源和培養基配制是減低污染的方法。
（十四）支原體(tǐ) （mycoplasma）污染的細胞， 對(duì)細胞培養有何影響
不能以肉眼觀(guān)察出支原體污染異狀。除極(jí)有經驗的專家外 ，大多數遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀(guān)分辨。
支原體污染幾乎可影響所有細胞的生長參(cān)數，代謝及研究任一數據。故進行實驗前，必須確(què)認細胞爲 mycoplasma-free，實驗結果的數據方有意義。
（十五）培養基保存於 4 ℃ 冰箱中，顔色會偏暗紅色，且 pH 值會越來越偏堿性
培養基保存於(yú)4 ℃冰箱中，培養基内的 CO2 會逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性，而培養基中的酸堿指示劑 （通常爲 phenol red） 的顔色也會随堿性增加而更偏暗紅 。培養基偏堿的結果， 将造成細胞生長(zhǎng)停滞或死亡。若培養基偏堿時，可以通入無菌過濾 CO2 ，以調整 pH 值。或酸堿調PH。
（十六）L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？
L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基後，L-谷氨酰胺可作爲培養細胞的能量來源、參(cān)與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間後會降解，L-谷氨酰胺的降解導緻氨的形成，而氨對於(yú)一些細胞具有毒性。
（十七）什麽培養基中可以省去加酚紅？培養基中丙酮酸鈉的作用是什麽？
酚紅在培養基中被用來作爲 PH 值的指示劑 ：中性時爲紅色，酸性時爲黃色，堿性時爲紫色。由於(yú)酚紅幹擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細胞檢測(cè)時，不使用加有酚紅的培養基。
丙酮酸鈉可以作爲細胞培養中的替代碳源，盡管細胞更傾向於(yú)以葡萄糖作爲碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話(huà)，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。
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