很多人第一次做ELISA實驗，覺得真簡單，無非就是加樣，保溫，洗滌等操作步驟。可是第二次做ELISA實驗，實驗結果怎麽差那麽多？同一份樣本怎麽可能呢？第三次做ELISA，決定認真一些，實驗結果還是不盡人意 ，诶 ，也太難瞭(le)！今天小編(biān)就給大家總結一下ELISA實驗要點，掌握這些，實驗So easy！
ELISA實(shí)驗操作注意要點(diǎn)
一、加樣
在 ELISA 中除瞭(le)包被外 ，一般需進行 4－5 次加樣 。在定性測定中有時不強調加樣量的準確性 ，例如規定爲加樣一滴。此時應該使用相同口徑的滴管，保持準確的加樣姿勢，使每滴液體的體積基本相同。在定量測定中則加樣量應力求準確。标本和結合物的稀釋液應按規定配制 。加樣時應将液體加在孔底，避免加在孔壁上部，並(bìng)注意不可出現氣泡。
1. 吸取樣品時，加樣槍吸頭不應黏附多餘的液體；加樣時不可90度向孔中滴加液體，這樣會導緻液體殘(cán)留在吸頭上，加樣不準確(què)！
2. 不要将吸頭伸入孔中，一方面若接觸(chù)孔底可能壓彎吸頭，另一方面可能會将孔中的液體吹起來，加樣不準確(què)！
3.正確(què)的加樣方法應爲45度，吸頭貼著(zhe)孔壁加入，應注意：
①角度太小，會使液體殘(cán)留在孔壁上，導緻加樣不準確(què)！
②吸頭應當貼著(zhe)管壁和液面的交界處(chù)！
二、保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加标本和加酶結合物後。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過(guò)程稱(chēng)爲溫育(incubation)，有人稱(chēng)之爲孵育。
ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結合隻在固相表面上發生 。以抗體包被的夾心法爲例 ，加入闆孔中的标本，其中的抗原並(bìng)不是都有均等的和固相抗結合的機會，隻有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其後加入的酶标記抗體與固相抗原的結合也同樣如此 。這就是爲什麽ELISA反應總是需要一定時間的溫育。
在 ELISA 中一般有二次抗原抗體反應，即加标本後和加結合物後 ，此時反應的溫度和時間應按規定的要求，保溫容器好是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各 ELISA 闆不應疊在一起 。爲避免蒸發，闆上應加蓋，或将闆平放在底部墊有濕紗布的濕盒中。濕盒應該是金屬的 ，傳(chuán)熱容易。如用保溫箱，空濕盒應預先放在其中，以平衡溫度，這在室溫較低時更爲重要 。加入底物後，反應的時間和溫度通常不做嚴格要求。如室溫高於(yú) 20℃，ELISA 闆可避光放在實驗台上，以便不時觀察，待對照管顯色适當時，即可終止酶反應。
三、洗滌
洗滌在 ELISA 過程中不是反應聚，但卻是決定實驗成敗的關鍵。洗滌的目的是洗去反應液中沒有與固相抗原或抗體結合的物質以及在反應過程中非特異性吸附於(yú)固相載體的幹擾物質。聚苯乙烯待塑料對蛋白質的吸附作用是普遍性的。因此在 ELISA 測定的反應過程中應盡量避免非特異性吸附，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的幹擾物質洗滌下來。在标本和結合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯（吐溫，Tween）一類物質即右達到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，爲非離子型的表面張力物質，常作爲助溶劑。根據脂肪酸的種類而對聚山梨酯編号，結合月桂酸的爲聚山梨酯 20，在 ELISA 中爲常用。它的洗滌效果好，並(bìng)具有減少非特異性吸附和增強抗原抗體結合的作用。
洗滌(dí)如不*，特别在後一次，如有酶結合物的非特異性吸附，将使空白值升高。另外，在間接法中如血清标本内的非特異性 IgG 吸附在固相上而未被洗淨，也将與酶标抗體作用而産(chǎn)生幹擾。
ELISA 闆的洗滌(dí)一般可採(cǎi)用以下方法 ：
①吸幹孔内反應液；
②将洗滌液注滿闆孔；
③放置 2 min，略作搖(yáo)動(dòng)；
④吸幹(gàn)孔内液，也可傾去液體後在吸水紙上拍幹(gàn)。洗滌(dí)的次數一般爲 3～4 次，有時甚至需洗 5～6 次。
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