恒遠生物|蛋白質相互作用

蛋白質相互作用是指兩個或兩個以上蛋白質分子通過非共價鍵形成蛋白質複(fù)合物的過程。如複(fù)制、轉錄、翻譯、細胞周期調(diào)控、物質代謝等。





常見的研究方法有：

酵母雙雜交技術、免疫共沉澱(diàn)、親和層(céng)析、細胞内共定位分析。

以下是對免疫共沉澱(diàn)技術（co-immunoprecipitation,co-IP）進行總結，co-IP常用來檢測(cè)兩種蛋白質在體内是否結合。




基本原理：

在保證兩種蛋白質相互作用的條件下，收集並(bìng)裂解細胞。在細胞裂解液中加入某一種已知蛋白的特異性抗體，孵育後再加入可與特異性抗體結合的蛋白A/G-瓊脂糖珠（或磁珠）沉澱(diàn)收獲抗原抗體複合物，若細胞中存在與已知蛋白結合的目标蛋白，則可被磁珠沉澱(diàn)下倆，形成“目标蛋白-已知蛋白-抗已知蛋白抗體-磁珠"複合物。經SDS-PAGE後，複合物可被分離，再經免疫印迹或質譜鑒定出目标蛋白。




優勢：




① 得到的蛋白質(zhì)相互作用是在細(xì)胞内天然形成的，反映的是細(xì)胞的生理狀态；




② 可以分離(lí)得到天然狀态的蛋白質複(fù)合物。




劣勢：




① 可能檢(jiǎn)測(cè)不到低親和力的瞬時蛋白質-蛋白質相互作用；




② 不能證明兩(liǎng)種蛋白質的直接結(jié)合，其他分子可能起到橋梁作用；




③ 依賴於(yú)高質量的、可用於(yú)免疫沉澱(diàn)的特異性抗體。




不同類型的免疫共沉澱技術




1、二次免疫共沉澱技術：用來檢測(cè)細胞内三種蛋白質間的相互作用，若要證明X、Y、Z三種蛋白質間是否以複合物形式存在，首先在細胞裂解液中加入抗X蛋白質抗體，免疫沉澱獲得抗原抗體複合物，經過非變(biàn)性洗脫後，向此複合物溶液中加入抗蛋白質Y的抗體，再收集免疫複合物進行SDS-PAGE分析。




2、蛋白質降解抑制-免疫共沉澱(diàn)：若兩種蛋白質結合後(hòu)，其中一種會降解，則會影響IP實驗結果，故需要抑制細胞内蛋白質降解。




① 對於(yú)通過溶酶體途徑降解的蛋白質，可以加入NH4Cl或氯喹改變(biàn)細胞内酸性環境，抑制這類蛋白質降解。




② 對(duì)於(yú)通過泛素-蛋白酶體途徑降解的蛋白質，可用MG132抑制，該試劑對(duì)細胞有毒性，故作用時間不能太久。




3、核質分離-免疫共沉澱(diàn)
：體内的許多蛋白質是在細胞質和細胞核之間穿梭的，研究時有時會(huì)出現時空問題。故先利用核質分離技術得到細胞核或細胞質完整的組分。




4、交聯免疫共沉澱(diàn)：能夠(gòu)使已經結合在一起的蛋白質更加穩定。避免結合能力弱或瞬時結合的蛋白質在實驗過程中降解。