細胞凍存及複蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多採(cǎi)用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞内的水分滲出細胞外 ，減少細胞内冰晶的形成 ，從而減少由於(yú)冰晶形成造成的細胞損傷。複蘇細胞應採(cǎi)用快速融化的方法 ，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間内即融化，避免由於(yú)緩慢融化使水分滲入細胞内形成胞内再結晶對細胞造成損傷。
細胞複蘇是一個簡單(dān)的試驗操作，但操作中也有許多需要注意的事項，在實驗操作中注意細小的問題 ，才能使複蘇後的細胞保持良好的狀态，針對細胞複蘇應該注意以下幾點(diǎn)：
1. 可以提前把需要的體積的培養液放到培養瓶裏，擰松瓶蓋(gài)，放到孵箱裏30分鍾--1個(gè)小時；
2. 爲防止凍(dòng)存管在升溫時出現爆裂等情況 ，可以在放入水浴前就把超淨台裏的蓋(gài)子擰松一下然後再擰上；
3. 水浴溫(wēn)度37℃左右。
一 、凍(dòng)存和複(fù)蘇的原則：慢凍(dòng)快融
當細胞冷到零度以下，可以産生以下變(biàn)化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，並(bìng)在細胞内形成冰晶。
如果緩慢冷凍(dòng)，可使細胞逐步脫水，細胞内不會産(chǎn)生大的冰晶；如果快速冷凍(dòng)的話，細胞内就會産(chǎn)生大的冰晶，大結晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。複蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶 ，即冰晶的重結晶。
二、慢凍程序
1. 标準程序：採(cǎi)用細胞凍(dòng)存器
當(dāng)溫度在-25 ℃以上時(shí) ，1~2 ℃/min；
當(dāng)溫度達(dá)-25 ℃以下時，5~10 ℃/min；
當(dāng)溫度達(dá)-100℃時，可迅速放入液氮中 。
2. 簡易程序 ：将冷凍(dòng)管（管口要朝上）放入紗布袋内，紗布袋系以線繩 ，通過線繩将紗布袋固定於(yú)液氮罐罐口 ，按每分鍾溫度下降1~2 ℃的速度，在40 min内降至液氮表面過夜，次日早晨投人液氮中 。
3. 傳統程序：冷凍管置於(yú)4℃ 10 分鍾→ -20℃ 30 分鍾→ -80℃ 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽長(zhǎng)期儲存 。
三、低溫保護劑的應用
在細胞凍(dòng)存時加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍(dòng)存效果 。
常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結過程，能使細胞内水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞内冰晶，從(cóng)而減少冰晶對細胞的損傷。
四、細胞凍存方法
1. 預(yù)先配制凍(dòng)存液
（1）10%DMSO + 細胞生長(zhǎng)液（20%血清+基礎(chǔ)培養液）
（2）10%甘油+ 細胞生長(zhǎng)液（20%血清+基礎(chǔ)培養液）
2. 取對數生長(zhǎng)期細胞，經胰酶消化後，加入适量凍(dòng)存液， 用吸管吹打制成細胞懸液（1×106 ~ 5 ×106細胞/ml）。
3. 加入1 ml細胞於(yú)凍存管中，密封後标記冷凍細胞名稱和冷凍日期。液氮長(zhǎng)期保存。
五、保存細胞的複蘇方法
1. 快速解凍(dòng)
凍存細胞從(cóng)液氮中取出後，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在1 分鍾内全部融化（不要超過3 分鍾）。
2. 解凍(dòng)後的細胞可直接接種到生長(zhǎng)培養液的細胞培養瓶中直接進行培養，24小時後再用新鮮培養液替換舊培養液，以去除DMSO。
3. 如果細胞對(duì)冷凍(dòng)保護劑特别敏感
解凍(dòng)後的細胞應先通過離心去除冷凍(dòng)保護劑，然後再接種到生長(zhǎng)培養液的培養瓶中。
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