RACE技術的原理

　　RACE技術日益完善，目前己有商業化RACE技術産品推出，如CLONTECH的Maratho^TM技術和SMART^TM RACE技術。邢桂春等（2001）先後使用上述兩種試劑盒進行RACE反應，結果發現使用Marathon^TM所得到的片斷總是比採用SMART^TM RACE試劑盒到所得到的片斷短。其原因在於Marathon^TM技術反轉錄反應往往不能真正達到mRNA的5' 末端。所以認爲，進行RACE反應應當優選SMART^TM RACE試劑盒。以下就國内目前應用zui廣的SMART^TM RACE試劑盒爲例，簡要概述RACE技術的原理和操作過程。

SMART^TM 3'-RACE的原理

　　利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作爲一個(gè)引物結合位點(diǎn)，以連有SMART寡核營酸序列通用接頭引物的Oligo（dT）30MN作爲鎖定引物反轉錄合成标準*鏈cDNA.然後用一個(gè)基因特異引物GSP1（gene specific primer，GSP）作爲上遊引物，用一個(gè)含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作爲下遊引物，以cDNA*鏈爲模闆，進行PCR循環，把目的基因3' 末端的DNA片段擴增出來。

SMART^TM 5'-RACE的原理

　　先利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作爲一個引物結合位點，以Oligo（dT）30MN作爲鎖定引物在反轉錄酶MMLV作用下，反轉錄合成标準*鏈cDNA.利用該反轉錄酶具有的末端轉移酶活性，在反轉錄達到*鏈的5'末端時自動加上3-5個（dC）殘(cán)基，退火後（dC）殘(cán)基與含有SMART寡核苷酸序列Oliogo（dG）通用接頭引物配對後，轉換爲以SMART序列爲模闆繼續延伸而連上通用接頭（見Figure 2 ）。然後用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作爲上遊引物，用一個基因特異引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作爲下遊引物，以SMART*鏈cDNA爲模闆，進行PCR循環，把目的基因5'末端的cDNA片段擴增出來。zui終，從2個有相互重疊序列的3'/ 5'-RACE産(chǎn)物中獲得全長cDNA，或者通過分析RACE産(chǎn)物的3'和5'端序列
，合成相應引物擴增出全長cDNA。

實驗中發(fā)現，做RACE反應實驗實際操作中仍存在不少困難。因此，對(duì)RACE反應條件進行反複摸索是十分必要的。這是因爲
：

*，在5'-RACE包含瞭(le)有3個連續的酶反應步驟（反轉錄、同聚物加尾和PCR擴增），每一步都可能導緻失敗(bài)；

第二，擴增DNA末端的特異性*依賴錨定引物及擴增DNA模闆樣品的不均一性，因而特異性一般很低，常呈現不清晰的成片條帶或截短的産(chǎn)物背景。因此，使用RACE技術擴增得到的特異末端片段
，所獲得的重組克隆能夠全部測(cè)序
，以排除RACE實驗結果中擴增産(chǎn)物假陽性和假陰性，zui終有可能獲得新基因的全序列。

随著(zhe)RACE的不斷改進和完善，優化條件下PCR擴增效率和忠實性的提高及PCR産(chǎn)物克隆技術的迅速發展，RACE必将在基因克隆及基因表達研究中發揮越來越大的作用。

RACE的另一種代表方法-Self-Ligation法

1. 反轉錄(lù)（RT）反應(yīng)。

2. Hybrid RNA的分解。

3. 單(dān)鏈cDNA的自身連(lián)接。

4. PCR擴(kuò)增5'未知區(qū)域。

5. 目的DNA片段的切膠(jiāo)回收。

6. DNA序列測定。

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