免疫熒光技術又稱(chēng)熒光抗體技術 ，是标記免疫技術中發展zui早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術 。很早以來就有一些學者試圖将抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞内抗原物質的定位 。
該(gāi)技術的主要特點(diǎn)是：特異性強、敏感性高 、速度快。
主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未完quan解決，結果判定的客觀性不足，技術程序也還比較複(fù)雜。
一、原理
免疫學的基本反應是抗原-抗體反應。由於(yú)抗原抗體反應具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發生反應時，隻要知道其中的一個因素 ，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術就是将不影響抗原抗體活性的熒光色素标記在抗體（或抗原）上 ，與其相應的抗原（或抗體）結合後，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應。
直接法：将标記的特異性熒光抗體 ，直接加在抗原标本上，經一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參(cān)加反應的多餘熒光抗體 ，室溫下幹(gàn)燥後封片、鏡檢。
間接法 ：如檢查未知抗原，先用已知未标記的特異抗體（第一抗體）與抗原标本進行反應，用水洗去未反應的抗體，再用标記的抗抗體（第二抗體）與抗原标本反應 ，使之形成抗原—抗體—抗體複合物 ，再用水洗去未反應的标記抗體 ，幹燥、封片後鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原标本是已知的，待檢血清爲第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。标記的抗抗體是抗球蛋白抗體 ，同於(yú)血清球蛋白有種的特異性 ，如免疫抗雞血清球蛋白隻對雞的球蛋白發生反應，因此，制備(bèi)标記抗體适用於(yú)雞任何抗原的診斷。
二、技術分類 ：
1.熒光抗體技術(shù)（熒光顯微鏡(jìng)技術(shù)）
抗原抗體反應後(hòu) ，利用熒光顯微鏡判定結果的檢測(cè)方法。
2.免疫熒光測定技術：
抗原抗體反應後(hòu)，利用特殊儀器測(cè)定熒光強度而推算被測(cè)物濃度的檢測(cè)方法。
1）熒光物質
熒光色素
許多物質都可産(chǎn)生熒光現象，但並(bìng)非都可用作熒光色素 。隻有那些能産(chǎn)生明顯的熒光並(bìng)能作爲染料使用的有機化合物才能稱爲免疫熒光色素或熒光染料。
常用的熒光色素：
（1）異硫氰酸熒光素爲黃色或橙黃色結晶粉末，易溶於(yú)水或酒精等溶劑。分子量爲389.4，zui大吸收光波長(zhǎng)爲490495nm，zui大發射光波長(zhǎng)520530nm，呈現明亮的黃綠色熒光有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩定性、與蛋白質結合能力等方面都geng好，在冷暗幹燥處可保存多年 ，是應用zui廣泛的熒光素 。
其主要優點是：
①人眼對黃綠色較爲敏感
②通常切片标本中的綠色熒光少於(yú)紅(hóng)色 。
（2）四乙基羅丹明爲橘紅色粉末，不溶於(yú)水，易溶於(yú)酒精和丙-酮。性質穩定，可長(zhǎng)期保存。zui大吸收光波長(zhǎng)爲570nm，zui大發射光波長(zhǎng)爲595-600nm，呈橘紅色熒光。
（3）四甲基異硫氰酸羅丹明，zui大吸引光波長(zhǎng)爲550nm，zui大發射光波長(zhǎng)爲620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用於(yú)雙重标記或對比染色。其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低。
常見熒光素的特性：
1）FITC：黃(huáng)色結晶粉末，吸收光：490～495nm，發(fā)射光：520～530nm，明亮的黃(huáng)綠色熒光。
2）RB200： 橘紅(hóng)色粉末, 吸收光570nm，發(fā)射光 595～600nm，橘紅(hóng)色熒光。
3）TRITC： 紫紅(hóng)色粉末，吸收550nm，發(fā)射光 620nm，橙紅(hóng)色熒光。
4）镧系：Eu3+、Tb3+
5）PE：吸收光490～560nm，發(fā)射光 595nm，紅(hóng)色熒光。
6）其它：酶作用後(hòu)産(chǎn)生熒光物質。
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