大鼠 （Rat） IV型膠原 （Co IV） ELISA 檢測試劑盒
本試劑僅供研究使用 标本：血清或血漿
試驗原理：
Co IV試劑(jì)盒是固相夾(jiā)心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知Co IV濃度的标準品、未知濃度的樣品加入微孔酶标闆内進行檢(jiǎn)測(cè)。先将Co IV和生物素标記的抗體同時溫育。洗滌(dí)後 ，加入親和素标記過(guò)的HRP。再經過(guò)溫育和洗滌(dí)，去除未結合的酶結合物，然後加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。産(chǎn)生顔色 。顔色的深淺和樣品中Co IV的濃度呈比例關系。
試劑盒内容及其配制
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試劑盒成份（2-8℃保存） |
96孔配置 |
48孔配置 |
配制 |
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96/48人份酶标闆 |
1塊闆（96T） |
半塊闆（48T） |
即用型 |
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塑料膜闆蓋 |
1塊 |
半塊 |
即用型 |
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标準品：800ng/ml |
1瓶（0.6ml） |
1瓶（0.3ml） |
按說明書進行稀稀 |
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空白對照 |
1瓶（1.0ml） |
1瓶（0.5ml） |
即用型 |
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标準品稀釋緩沖液 |
1瓶（5ml） |
1瓶（2.5ml） |
即用型 |
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生物素标記的抗Co IV抗體 |
1瓶（6ml） |
1瓶（3.0ml） |
即用型 |
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親和鏈酶素-HRP |
1瓶（10ml） |
1瓶（5.0ml） |
即用型 |
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洗滌緩沖液 |
1瓶（20ml） |
1瓶（10ml） |
按說明書進行稀釋 |
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底物A |
1瓶（6.0ml） |
1瓶（3.0ml） |
即用型 |
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底物B |
1瓶（6.0ml） |
1瓶（3.0ml） |
即用型 |
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終止液 |
1瓶（6.0ml） |
1瓶（3.0ml） |
即用型 |
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标本稀釋液 |
1瓶（12ml） |
1瓶（6.0ml） |
即用型 |
自備材料
1． 蒸餾水 。
2． 加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3． 振蕩(dàng)器及磁力攪(jiǎo)拌器等。
安全性
1． 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸(chù)到這些液體，請盡快用水沖(chōng)洗 。
2． 實(shí)驗中不要吃喝、抽煙(yān)或使用化妝品。
3． 不要用嘴吸取試劑(jì)盒裏(lǐ)的任何成份。
大鼠IV型膠原ELISA檢測試劑盒操作注意事項
1． 試劑應按标簽說明書儲(chǔ)存，使用前恢複(fù)到室溫。稀稀過後的标準品應丢棄，不可保存 。
2． 實(shí)驗中不用的闆條應立即放回包裝袋中，密封保存 ，以免變(biàn)質 。
3． 不用的其它試劑(jì)應包裝好或蓋(gài)好 。不同批号的試劑(jì)不要混用。保質前使用。
4． 使用一次性的吸頭(tóu)以免交叉污染 ，吸取終(zhōng)止液和底物A、B液時(shí)，避免使用帶(dài)金屬部分的加樣器 。
5． 使用幹(gàn)淨的塑料容器配置洗滌(dí)液。使用前充分混勻試劑盒裏的各種成份及樣品 。
6． 洗滌(dí)酶标闆時應充分拍幹(gàn) ，不要将吸水紙直接放入酶标反應孔中吸水。
7． 底物A應揮發(fā) ，避免長(zhǎng)時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長(zhǎng)時間暴露於(yú)光下 。避免用手接觸 ，有毒 。實驗完成後應立即讀取OD值。
8． 加入試劑(jì)的順序應一緻 ，以保證所有反應闆孔溫育的時間(jiān)一樣。
9． 按照說明書中标明的時間(jiān)、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。
樣(yàng)品收集、處(chù)理及保存方法
1、 血清-----操作過(guò)程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和内毒素的試管。收集血液後(hòu)，1000×g離心10分鍾将血清和紅(hóng)細胞迅速小心地分離(lí) 。
2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用於(yú)檢測(cè)。1000×g離心30分鍾去除顆粒 。
3、 細胞上清液---1000×g離心10分鍾(zhōng)去除顆(kē)粒和聚合物 。
4、 組織勻漿-----将組織加入适量生理鹽(yán)水搗(dǎo)碎 。1000×g離心10分鍾，取上清液
5、 保存------如果樣(yàng)品不立即使用，應(yīng)将其分成小部分-70 ℃保存 ，避免反複冷凍(dòng)。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測(cè)前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍並(bìng)確(què)保樣品均勻地充分解凍 。
試劑的準備
1． 标準品：标準品的系列稀釋應在實驗時準備(bèi) ，不能儲(chǔ)存。稀釋前将标準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：
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800 ng/ml |
（6号标準品） |
原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。 |
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400 ng/ml |
（5号标準品） |
100ul的原倍标準品加入100ul的标準品稀釋液 |
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200 ng/ml |
（4号标準品） |
100ul的5号标準品加入100ul的标準品稀釋液 |
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100 ng/ml |
（3号标準品） |
100ul的4号标準品加入100ul的标準品稀釋液 |
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50 ng/ml |
（2号标準品） |
100ul的3号标準品加入100ul的标準品稀釋液 |
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25 ng/ml |
（1号标準品） |
100ul的2号标準品加入100ul的标準品稀釋液 |
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0 ng/ml |
（空白對照） |
原始濃度不用稀釋直接加入50ul。 |
2． 洗滌緩沖液（50×）的稀釋(shì)：蒸餾(liú)水50倍稀釋。
1． 使用前，将所有試劑(jì)充分混勻。不要使液體産(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，産(chǎn)生加樣上的誤差 。
2． 根據待測(cè)樣品數量加上标準品的數量決定所需的闆條數。每個标準品和空白孔建議做複(fù)孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用複(fù)孔的盡量做複(fù)孔。标本用标本稀釋液1：1稀釋後加入50ul於反應孔内。
3． 加入稀釋好後的标準品50ul於(yú)反應孔、加入待測(cè)樣品50ul於反應孔内 。立即加入50ul的生物素标記的抗體。蓋(gài)上膜闆，輕輕振蕩(dàng)混勻，37℃溫育1小時。
4． 甩去孔内液體，每孔加滿洗滌(dí)液，振蕩(dàng)30秒 ，甩去洗滌(dí)液，用吸水紙拍幹。重複(fù)此操作3次。如果用洗闆機(jī)洗滌(dí)，洗滌(dí)次數增加一次。
5． 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻 ，37℃溫育30分鍾。
6． 甩去孔内液體，每孔加滿洗滌(dí)液，振蕩(dàng)30秒，甩去洗滌(dí)液，用吸水紙拍幹。重複(fù)此操作3次。如果用洗闆機(jī)洗滌(dí)，洗滌(dí)次數增加一次。
7． 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鍾。避免光照。
8． 取出酶标闆，迅速加入50ul終止液，加入終止液後(hòu)應立即測(cè)定結果。
9． 在450nm波長處測定各孔的OD值。
建議使用的實驗方案
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标準品濃度（ng/ml） |
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A |
800 |
800 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
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B |
400 |
400 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
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C |
200 |
200 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
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D |
100 |
100 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
|
E |
50 |
50 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
|
F |
25 |
25 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
|
G |
0 |
0 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
|
H |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
局限
6号标準品以上的結(jié)果爲非線性的，根據(jù)此标準曲線無法得到的結(jié)果。
試劑盒性能
1. 靈敏度：zui小的檢測(cè)濃度小於(yú)1号标準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸(guī)與預期濃度相關(guān)系數R值爲0.990。
2. 特異(yì)性：不與其它細(xì)胞因子反應。
3. 重複性：闆内、闆間變(biàn)異系數均小於(yú)10%。
結 果 判 斷 與 分 析
1、儀器值：於波長450nm的酶标儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值爲縱坐标（Y），相應的Co IV标準品濃度爲橫坐标（X），做得相應的曲線(xiàn)，樣(yàng)品的Co IV含量可根據其OD值由标準曲線換(huàn)算出相應的濃(nóng)度。
3、檢測值範圍：0-800ng/ml
4、敏感度： 1.0 ng/ml
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