細胞凋亡是一種細胞主動有序的死亡，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等作用，它並(bìng)不是病理條件下自體損傷的一種現象，而是爲瞭(le)更好地适應生存環境而主動争取的一種死亡。本期恒遠生物給大家介紹細胞凋亡檢測實驗的方法，一起來學習下吧！
一 、PI 單染色法
1. 收集細胞｛數目約（1~ 5）×106 個(gè)/mL｝，500 ~ 1000 r/min 離(lí)心 5min，棄去培養液 。
2. 3ml PBS 洗滌(dí) 1 次。
3. 離(lí)心去 PBS，加入冰預冷的 70%的乙醇固定，4℃，1—2 小時(shí)。
4. 離(lí)心棄(qì)去固定液，3mlPBS 重懸 5min。
5. 400 目的篩網過(guò)濾 1 次，500—1000r/min 離(lí)心 5min，棄去 PBS。
6. 用 1ml PI 染液染色，4℃避光 30min。
7. 流式細胞儀檢測：PI 用氩離子激發熒光，激光光波波長爲 488nm，發射光波波長大於(yú)630nm，産生紅色熒光分析 PI 熒光強度的直方圖也可分析前散射光對側(cè)散射光的散點圖。
8. 結果判斷：在前散射光對側散射光的散點圖或地形圖上，凋亡細胞與正常細胞相比，前散射光降低 ，而側散射光可高可低，與細胞的類型有關；在分析 PI 熒光的直方圖時，先用門技術排除成雙或聚集的細胞以及發微弱熒光的細胞碎片，在 PI 熒光的直方圖上，凋亡細胞在G1/G0 期前出現一亞二倍體峰。如以 G1/G0 期所在位置的熒光強度爲 1.0，則一個典型的凋亡細胞樣本其亞二倍體峰的熒光強度爲 0.45，可用雞和鲑魚的紅細胞的 PI 熒光強度做參(cān)照标準 ，兩者分别爲 0.35 和 0.7，可以確(què)保在兩者之間的不是細胞碎片而是完整的細胞。
注意事項：
細胞凋亡時 ，其 DNA 可染性降低被認爲是凋亡細胞的标志之一，但這種 DNA 可染性降低也可能是因爲 DNA 含量的降低，或者是因爲 DNA 結構的改變(biàn)使其與染料結合的能力發(fā)生改變(biàn)所緻。在分析結果時應該注意。
二、Annexin V/PI 雙(shuāng)染色法
1. 細胞收集：懸浮細胞直接收集到 10ml 的離(lí)心管中 ，每樣本細胞數爲（1~5）×106，/mL 500~1000r/min 離(lí)心 5min，棄(qì)去培養液 。
2. 用孵育緩沖(chōng)液洗滌(dí) 1 次 ，500~1000r/min 離心 5min。
3. 用 100ul 的标記(jì)溶液重懸細胞，室溫(wēn)下避光孵育 10~15min。
4. 500~1000r/min 離心 5min 沉澱(diàn)細胞孵育緩沖(chōng)液洗 1 次 。
5. 加入熒光（SA-FLOUS）溶液 4℃下孵育 20min，避光並(bìng)不時振動(dòng)。
6. 流式細胞儀分析 ：流式細胞儀激發光波長用 488nm，用一波長爲 515nm 的通帶濾器檢測(cè) FITC 熒光，另一波長大於(yú) 560nm 的濾器檢測(cè) PI。
7. 結果判斷(duàn)：凋亡細胞對所有用於(yú)細胞活性鑒定的染料如 PI 有抗染性，壞死細胞則不能 。
總結：細胞膜有損傷的細胞的 DNA 可被 PI 著(zhe)染産生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光産生。因此，在細胞凋亡的早期 PI 不會著(zhe)染而沒有紅色熒光信号。正常活細胞與此相似。在雙變(biàn)量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，爲（FITC-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，爲（FITC+/PI+）；而右下象限爲凋亡細胞，顯現（FITC+/PI- ）
三、Heochst 33342/PI 雙(shuāng)染色法
1. 懸浮生長(zhǎng)的細胞在培養的狀态下加入 Heochst 33342 ，終濃(nóng)度爲 1ug/ml； 37℃孵育7—10min。
2. 低溫 500 ~ 1000r/min 離(lí)心 5min 棄(qì)去染液。
3. 加入 1.0ml PI 染液，4℃避光染色 15min。
4. 400 目的篩網過(guò)濾(lǜ) 1 次。
5. 流式細胞儀分析：Heochst 33342 用氪激光激發的紫外線熒光，激發光波波長爲352nm，發射光波波長爲 400 ~ 500nm，産(chǎn)生蘭色熒光；PI 用氩離子激光激發熒光，激發光波波長爲 488nm，發射光波波長大於(yú) 630nm，産(chǎn)生紅色熒光。分析蘭色熒光對紅色熒光的散點圖或地形圖。
6. 結果判斷(duàn)：在蘭色熒光對紅色熒光的散點(diǎn)圖上，結果爲 ：正常細胞爲低藍光/低紅光，凋亡細胞爲高藍光/低紅光，壞死細胞爲低藍光/高紅光。
注意事項：
① 在紅色熒光對(duì)蘭色熒光散點(diǎn)圖上，還可見到細胞凋亡區向細胞壞死區遷移的軌迹 ，可能是凋亡細胞的 DNA 進一步降解的緣故。
② 用 Heochst 33342 染料與細胞孵育的時間不宜過長(zhǎng)，一般控制在 20min 之内爲宜 。如果太長(zhǎng)可引起 Heochst 33342 的發射光譜由藍光向紅光的遷移，導緻紅色熒光與蘭色熒光的比例改變(biàn)，從而影響結果的判斷。
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