一個準確(què)的ELISA檢測實驗，必須包含三大要素：性能可靠的試劑盒、造模成功並(bìng)準確(què)採集的樣本、可控環境且嚴謹實驗操作，三者缺一不可。在操作過程中，經常遇到樣本稀釋問題，需要進行樣本稀釋。
一、在ELISA實驗過程中 ，超過試劑盒檢測(cè)範(fàn)圍的 ，樣本值高的可能情況
1、樣本中待測(cè)物含量過高。一些高豐度蛋白來說，比如免疫球蛋白 、脂聯素、C肽、載脂蛋白等 ，在樣本中本身含量就很高，有的達(dá)到mg/mL濃度 。
2、一些受誘導表達(dá)的細胞上清中，大量表達(dá)，比如小鼠細胞誘導後 ，大量表達(dá)腫瘤壞死因子α（TNFα），小鼠胰島(dǎo)細胞受誘導後，大量表達(dá)胰島(dǎo)素（INS）。
3、在一些感染性疾病中，大量表達(dá)，比如乙肝表面抗原、C反應(yīng)蛋白。
4、疫苗原性研究時 ，注射疫苗的小鼠，會産(chǎn)生大量針對(duì)疫苗的抗體 。
5、一些被濃縮的樣品 ，比如重組蛋白的産(chǎn)物，單克隆抗體純(chún)品等。
二.在ELISA檢測(cè)過程中，經常會遇到這樣的問題：樣本測(cè)定OD值超過标曲最高點OD值 ，造成測(cè)定數據無法直接使用 。樣本必須進行稀釋，如何確(què)定測(cè)定樣本的稀釋倍數？ 樣本稀釋容易犯的錯誤有哪些？
1、稀釋不足 。稀釋倍數不足時 ，容易導(dǎo)緻最終結(jié)果偏小 。
2、過(guò)度稀釋 。過(guò)度稀釋時，容易導(dǎo)緻最終結果偏大。
3、稀釋不夠(gòu)規範(fàn)，引入很多人爲偏差。稀釋不夠(gòu)規範(fàn)，特别是大比例稀釋時，人爲偏差大大增加 。
三、如何確(què)定測定樣本的稀釋倍數呢？樣本稀釋的原則如下：在查詢背景知識，或者通過預實驗 ，確(què)認瞭(le)樣本濃度過高，需要進行稀釋，就要根據以下原則，嚴謹操作和計算。
1、稀釋倍數合理。稀釋後樣本測(cè)定的OD值，要求落在标準品最高值OD值的半量程内，假定标準品最高值的OD值是2.4，那麽稀釋後的樣本，OD值接近1.2，在這個範圍附近 ，計算的濃度值最爲準確(què)，以這個結果乘以稀釋倍數，得到的樣本濃度最準確(què)。
2、稀釋過程規範(fàn) 。特别是大倍比的稀釋，最好是梯度稀釋。比如樣本要稀釋200倍，就先稀釋10倍，再在10倍稀釋的基礎(chǔ)上，再進行稀釋20倍，得到200倍。
3、樣本取樣量不要太小。在樣本充足的情況下，樣本取樣量不要低於(yú)5uL，越低的取樣量，在混勻取樣過(guò)程中，誤差越大。
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