ELISA（酶聯免疫吸附試驗）預實驗是開展正式實驗前不可少的環節，主要用於(yú)摸索合适的實驗條件及確(què)定實驗的可行性。以下是ELISA預實驗的開展過程 ，一起來看看吧！
一、預實驗的目的
確(què)定實驗條件：如抗原或抗體的濃度、酶的種類和濃度、洗滌(dí)液的濃度和pH值等 ，以確(què)保實驗的準確(què)性和可靠性。
確(què)定實驗範(fàn)圍：包括最佳反應時間和濃度範(fàn)圍，以確(què)保在正式實驗中獲得最佳的實驗結果。
驗證實(shí)驗方法：確(què)保實(shí)驗方法的準確(què)性和可靠性。
減(jiǎn)少實驗誤差 ：提高實驗的重複(fù)性和可重複(fù)性。
二 、預實驗的方法
1.實驗樣本的選擇：
預實驗一般通過測定少數有代表性的樣本來確(què)定正式實驗方案。通常，測定的樣本會分爲不同的組别 ，不同組别的樣本由於(yú)前期處理或刺激後，靶标物的表達量會産生變化。建議從各組樣本中随機選擇1~2例樣本。如果正式實驗測定的樣本數量多，分配到預實驗的試劑量有限，那麽至少選擇兩例樣品，建議選用1例爲理論上靶标物含量zui低組的樣品，另1例爲理論上靶标物含量最高組的樣品。
2.最适稀釋倍數的確定：
①将樣本梯度稀釋 ，可根據(jù)樣本中靶标物的濃度 ，選擇2倍、5倍或10倍梯度稀釋 ，同時測(cè)定标準品 。
②标準品的制備(bèi)需按照試劑盒說明書的要求，試劑量充足可以選擇一條完整的标曲，試劑量有限也可以選擇部分濃度點(diǎn)（如空白孔、zui低濃度孔 、中間濃度孔以及最高濃度孔）。
③将測(cè)定的不同稀釋濃度的樣本測(cè)定的OD值（光密度值）與梯度濃度标準品OD值進行對比 ，最佳稀釋倍數爲此倍數稀釋後全部或絕大多數樣本OD值能夠位於(yú)标準曲線中間濃度孔對應的OD值，即标準曲線的最佳拟合區域。
④在做預實驗時，一定要設置标曲 ，不設置标曲則無法通過(guò)比較確(què)定最适稀釋倍數。
3.抗原包被濃度的設定：
①将抗原溶液分别按照1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml的濃(nóng)度稀釋(shì)在抗原包被液中。
②以等量随機選取的特異性抗體血清與抗原溶液反應，在37℃孵育1小時後清洗，然後加酶标二抗，孵育30分鍾清洗，zui hou加底物顯色，反應終止後用酶标儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的光密度值 。
③繪(huì)制ROC曲線（受試者工作特征曲線），找出臨(lín)界值。
4.酶标二抗稀釋(shì)比例的確(què)定：
①取已知陽性和陰性血清樣本 ，分别用ELISA稀釋液将特異性抗體稀釋成不同濃度的酶标二抗溶液 ，與包被抗原孵育、清洗後(hòu)加底物顯色，zui hou用酶标儀測(cè)定光密度值。
②繪(huì)制ROC曲線 ，找出臨(lín)界值。
5.顯色時間的確定：
①顯色是ELISA實(shí)驗中zui hou一步溫育反應 ，固定在酶标闆上的酶催化無色底物生成有色産(chǎn)物 。
②由於(yú)ELISA實驗會受到環境差異及實驗操作差異的影響，商業化的ELISA試劑盒通常不會推薦固定的顯色時間，而是建議實驗操作人員根據顯色情況判斷(duàn)合适的顯色反應時間。
③加入底物後可定時觀察反應孔的顔色變(biàn)化（如每隔5分鍾觀察一次），當标準孔的前3~4孔有明顯的梯度藍色 ，後3~4孔梯度不明顯時 ，即可終止。通過預實驗熟悉操作的同時，也能確(què)定合适的顯色時間。
三、注意事項
①在進行預實驗時，應嚴格按照ELISA試劑盒的說明書進行操作，避免由於(yú)操作不當(dāng)導緻的實驗誤差。
②預實驗的結果應認真記(jì)錄和分析，以便爲正式實驗提供可靠的依據(jù)。
③在預實驗過程中，如發現任何異常或不符合預期的結果，應及時查找原因並(bìng)進行調(diào)整。
通過以上預實驗的設置和操作，可以對ELISA實驗的條件進行初步的摸索和優化，爲後續的正式實驗提供可靠的基礎。同時，也能及時發現實驗中存在的問題，進行針對性的改進，提高實驗的準確(què)性和可靠性。上海恒遠生物專業提供生命科學領域的技術服務，提供實驗技術服務，爲廣大科研工作者大大節省瞭(le)重複勞動的時間和精力，我們有過硬的技術咨詢和完善的售後服務，購買ELISA試劑盒贈送免費代測服務，在線一對一技術指導，爲您解決後顧之憂。
點擊交流