免疫組化實驗操作注意事項

免疫組化實驗是一項精密的技術操作，需要嚴格把控各個(gè)環節以確(què)保結果的準確(què)性和可靠性。以下是免疫組化實驗的關鍵注意事項：



一、血清封閉
血清封閉的目的是爲瞭(le)一抗與組織的非特異性結合，造成假陽性
，一般會採(cǎi)用BSA、羊血清等封閉這些位點，封閉血清一般是和二抗同一來源的，室溫封閉10-30min。


二、一抗和二抗濃(nóng)度和孵育時間(jiān)
不同的一抗濃度，孵育時間和溫度等對(duì)染色結果往往有較大的影響。在4℃下，反應緩慢，背景較淺；而37℃反應較快
，時間較短；室溫介於(yú)兩者之間，二抗一般室溫孵育30min。


三、DAB顯色
檢測背景的深淺和特異性染色的深淺基本上都以DAB孵育條件決定。DAB的顯色時間並(bìng)不是固定的，主要方法是使用顯微鏡控制顯色時間，到出現特異性染色較強且出現背景著(zhe)色較淺時就可以沖洗。如果DAB顯色時間過長（超過十分鍾）才出現陽性染色，可能是一抗體濃度過低或者封閉時間過長，也可以加入金屬離子來增強顯色（如硫酸銅、氯化钴、硫酸鎳铵等）；如果DAB顯色時間過短顔色就很深，這可能是一抗過高，需要下調抗體濃度，如果短時間内過深


四、複染
免疫組化染色後爲瞭(le)襯托出組織形态結構有必要進行複染，常用試劑爲Mayer’s蘇木染色，一般爲2 min左右，DAB在核蛋白著(zhe)色的時間可以适當縮短
，最後用氨水或PH 8.0的TBS返藍。


五、封片
在封片階段我們通常是用中性樹膠來進行，封片過程中注意斜靠蓋玻片防止氣泡的産(chǎn)生從而對結果進行營影響，建議最好在通風櫥操作，這樣有利於(yú)氣泡排除幹淨，不影響後續的鏡檢。


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