1. 把聚丙烯酰胺凝膠(jiāo)中的蛋白質電(diàn)泳轉移到硝酸纖維膜上。
1）轉移緩沖(chōng)液洗滌(dí)凝膠和硝酸纖維素膜，将硝酸纖維素膜鋪在凝膠上 ，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡 。
2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預先用轉移緩(huǎn)沖(chōng)液浸濕），将凝膠夾在中間 ，保持濕潤和沒有氣泡。
3）将此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠(chǎng)家建議方法放入電(diàn)泳裝置中，凝膠面向陰極。
4）将上述裝置放入緩沖(chōng)液槽中，並(bìng)灌滿轉移緩沖(chōng)液以淹沒凝膠。
5）按照廠(chǎng)家所示接通電(diàn)源開始電(diàn)泳轉移。
6）轉移結束後(hòu)，取出薄膜和凝膠(jiāo)，棄去凝膠(jiāo) 。
2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标準顯現時取出，記(jì)錄(lù)下标準位置。
3. 用100ml水洗滌(dí)纖維素膜 ，必要時可用脫色緩沖(chōng)液 。
4. 膜置印迹緩沖(chōng)液中於(yú)37℃保溫1小時。
5. 室溫下 ，用PBS-Tween緩沖(chōng)液洗滌(dí)薄膜。
6. 用封口機(jī)将薄膜封入塑料袋中 ，盡(jǐn)可能不留空氣。
7．袋的一角剪一緩(huǎn)沖(chōng)液的小口，用透析袋夾緊。
8．混合：NGS（100微升），印迹緩沖(chōng)液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，於(yú)室溫下搖動2小時（或4℃過夜）
9．用總體積300ml PBS-Tween緩沖(chōng)液，分4次在一淺盤中洗滌(dí)薄膜 ，每次75ml。
10. 将連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶於(yú)10毫升印迹緩沖(chōng)液/100微升 NGS）加在袋内，於(yú)室溫下搖動1小時。
11．按步驟9洗滌 。
12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶於(yú)10毫升印迹緩沖(chōng)液/100微升 NGS），於(yú)室溫下搖動。
注意事項：
western blot中轉移在膜上的蛋白處於(yú)變(biàn)性狀态，空間結構改變(biàn)，因此那些識别空間表位的抗體不能用於(yú)western blot檢測 。這種情況可以将表達目的蛋白的細胞或細胞裂解液中的所有蛋白物素化，再用酶标記親和素進行western blot。實驗中取膠和膜需帶手套。
1.蛋白質從(cóng)SDS聚丙烯酰胺凝膠(jiāo)轉移至硝酸纖維素膜（濕式轉膜）
1）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結束後，小心取出帶有凝膠的玻闆，用割膠刀沿下邊(biān)緣小心撬開短闆 ，按樣品的多少切下合适大小的凝膠。浸泡在轉膜緩沖(chōng)液中5分鍾左右，以平衡離子強度。視情況決定是否切角标記。
2）電(diàn)泳結(jié)束前，應泡好3M濾紙2-6張均可（普通濾紙也可）和1張硝酸纖維素濾膜。
3）戴上手套按如下順(shùn)序安裝轉(zhuǎn)移裝置：
a.平放底部電(diàn)極（陰極），放一張海綿墊(diàn)片 。
b.在海綿墊(diàn)片上放置1-3張用轉移緩沖(chōng)液浸泡過的濾紙，逐張疊放 ，對齊，然後用一玻璃棒作滾筒以擠出所有氣泡，必要時可滴加轉膜液潤濕。
c.取出浸在轉膜液中的凝膠(jiāo)平放於(yú)濾紙上。排除所有氣泡。
d.把硝酸纖維素濾膜放在聚丙烯酰胺凝膠(jiāo)上，在硝酸纖維素濾膜與聚丙烯酰胺凝膠(jiāo)之間(jiān)不留有氣泡。
e. 把zui後1-3張濾紙放在硝酸纖維素濾膜上方 ，同樣須確(què)保不留氣泡。其實，用玻棒給點(diǎn)壓力很容易排除氣泡。
f.放上另一張或幾張海綿墊(diàn)片，蓋上陽極闆，夾緊。保證對(duì)凝膠有一定的壓力。
4）連接電源。
我做90KD的蛋白，電(diàn)轉移100分鍾 ，電(diàn)壓100v。電(diàn)轉過程中，盡量給個低溫環境，我放在冰水裏轉膜，也用内置的冰盒或者是放在4-8攝氏度的層(céng)析櫃中。
5）斷開電源，拆卸轉移裝置，逐一掀去各層(céng)。将凝膠轉移至盛有考馬斯亮藍染液的托盤中，進行染色，可檢查蛋白質轉移是否*。要觀察膜上蛋白的情況可在麗春紅中染色3-10分鍾，然後蒸餾水沖(chōng)洗
6）切去濾(lǜ)膜的左下角，以标記(jì)，如有預染MARKER也可不标。
7）雜交與顯色 ： ① 封閉(bì) ② 一抗孵育：分别與相應的抗體及内參照抗體孵育 ③ 漂洗：室溫下以TBST液在平緩搖動條件下漂洗3次以上，每次各10min。 ④ 與二抗孵育 ：與辣根過化物酶标記的二抗孵育 ⑤ 漂洗：室溫下以TBST液在平緩搖動條件下漂洗4次以上，每次各10min。 ⑥ ECL顯像；⑦ 顯影定影完畢(bì).
點擊交流