細胞凋亡實驗步驟

 

 細胞凋亡檢測實驗

 

細胞凋亡檢測可以：

（1）用於(yú)腫瘤細胞和組織在内的不同種類(lèi)病理标本研究；

（2）應用於(yú)臨床診療，新藥研制、生物制品開發、腫瘤放化療、以及從(cóng)促凋亡角度探索腫瘤的基因治療；

（3）對(duì)相關疾病的早期發(fā)現、放化療的療效評價具有舉足輕重的地位。

實驗方法原理

本實驗用1μg/ml 三尖杉酯堿HT在體外誘導培養的HL-60細胞發(fā)生凋亡，同時也有少數細胞發(fā)生壞(huài)死
。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）對(duì)細胞進行雙重染色，可以區别凋亡、壞(huài)死及正常細胞。

 

三尖杉酯堿（HT）是我國自行研制的一種對(duì)急性粒細胞白血病，急性單(dān)核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml範圍内作用2小時，即可誘導HL-60細(xì)胞凋亡，並(bìng)表現出典型的凋亡特征。

細(xì)胞膜是一選(xuǎn)擇性的生物膜
，一般的生物染料如PI等不能穿過(guò)質膜。當(dāng)細胞壞死時，質膜不完整，PI就進(jìn)入細(xì)胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使壞死細胞著(zhe)色，凋亡細胞和活細胞不著(zhe)色。而一些活細胞染料由於(yú)爲親脂性物質，可跨膜進入活細胞，因而可進行活細胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較(jiào)弱，它是雙苯並(bìng)咪唑的一種衍生物。與DNA特異結合（主要結合於A-T）堿(jiǎn)基區(qū)），顯示凋亡細胞和活細胞。凡是看到有凋亡小體的細胞都是凋亡細胞。

實驗步驟

一、試劑準備

 

1.  三尖杉酯堿（HT）：300μg/ml；

 

2.  Tris-HCl（pH7.5）：100mmol/L；

 

3.  EDTA緩沖液：5mol/L；

 

4.   堿性裂解液：0.2mol/L NaOH；

 

5.        醋酸鈉：3mol/L KAc（pH4.8）；

注意事項

1.  誘導培養HL-60細胞時間要準確；

 

2.  熒光顯微鏡下觀(guān)察細胞時，由於(yú)熒光易碎滅，觀(guān)察時要盡量快。