大鼠腫瘤壞死因子試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用 目的：本試劑盒用於測定大鼠血清 ，血漿及相關液體樣本中腫瘤壞死因子的含量。
實驗原理：
本試劑盒應用雙抗體夾心法測(cè)定标本中大鼠腫瘤壞死因子水平。用純化的大鼠腫瘤壞死因子抗體包被微孔闆，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入腫瘤壞死因子再與HRP标記的腫瘤壞死因子抗體結合，形成抗體-抗原-酶标抗體複合物，經過*洗滌後加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，並(bìng)在酸的作用下轉化成zui終的黃色 。顔色的深淺和樣品中的腫瘤壞死因子呈正相關。用酶标儀在450nm波長下測(cè)定吸光度（OD值），通過标準曲線計算樣品中大鼠腫瘤壞死因子濃度。
試劑盒組成 ：
試(shì)劑(jì)盒組成 48孔配置 96孔配置 保存
說明書 1份 1份
封闆膜 2片（48） 2片（96）
密封袋 1個 1個
酶标包被闆(bǎn) 1×48 1×96 2-8℃保存
标準(zhǔn)品：360ng/L 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存
标準(zhǔn)品稀釋(shì)液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保存
酶标試(shì)劑(jì) 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
樣(yàng)品稀釋(shì)液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
顯(xiǎn)色劑(jì)A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
顯(xiǎn)色劑(jì)B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
終(zhōng)止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
濃(nóng)縮洗滌(dí)液 （20ml×20倍）×1瓶 （20ml×30倍）×1瓶 2-8℃保存
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鍾 ，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過(guò)程中如出現沉澱(diàn)，應再次離心。
2. 血漿 ：應根據标本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作爲抗凝劑，混合10-20分鍾後，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱(diàn)形成，應該(gāi)再次離心。
3. 尿液 ：用無菌管收集，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清 ，保存過程中如有沉澱(diàn)形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參(cān)照實行。
4. 細胞培養上清：檢測(cè)分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清 。檢測(cè)細胞内的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反複凍融，以使細胞破壞並(bìng)放出細胞内成份。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉澱形成 ，應再次離心。
5. 組織标本：切割标本後 ，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備(bèi)用。标本融化後仍然保持2-8℃的溫度 。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器将标本勻漿充分 。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝後一份待檢測(cè)，其餘冷凍備(bèi)用 。
6. 标本採(cǎi)集後盡早進行提取 ，提取按相關文獻進行 ，提取後應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可将标本放於(yú)-20℃保存 ，但應避免反複凍融.
7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟：
1. 标準品的稀釋與加樣 ：在酶标包被闆上設标準品孔10孔，在*、第二孔中分别加标準品100μl，然後(hòu)在*、第二孔中加标準品稀釋液50μl，混勻；然後(hòu)從(cóng)*孔 、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔 ，再在第三 、第四孔分别加标準品稀釋液50μl，混勻；然後(hòu)在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉 ，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五 、第六孔中分别加标準品稀釋液50ul，混勻；混勻後(hòu)從(cóng)第五 、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七 、第八孔中分别加标準品稀釋液50μl，混勻後(hòu)從(cóng)第七 、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标準品稀釋液50μl，混勻後(hòu)從(cóng)第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋後(hòu)各孔加樣量都爲50μl，濃度分别爲240ng/L，160ng/L ，80ng/L，40ng/L， 20ng/L）。
2. 加樣：分别設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶标試劑，其餘各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶标包被闆上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然後再加待測(cè)樣品10μl（樣品zui終稀釋度爲5倍）。加樣将樣品加於(yú)酶标闆孔底部，盡量不觸及孔壁 ，輕輕晃動混勻。
3. 溫(wēn)育：用封闆膜封闆後(hòu)置37℃溫(wēn)育30分鍾。
4. 配液：将30（48T的20倍）倍濃縮洗滌(dí)液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋後備(bèi)用。
5. 洗滌(dí)：小心揭掉封闆膜，棄去液體，甩幹，每孔加滿洗滌(dí)液，靜置30秒後棄去 ，如此重複(fù)5次，拍幹。
6. 加酶：每孔加入酶标試(shì)劑(jì)50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色 ：每孔先加入顯色劑(jì)A50μl，再加入顯色劑(jì)B50μl，輕輕震蕩(dàng)混勻，37℃避光顯色15分鍾.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍(lán)色立轉黃(huáng)色）。
11. 測(cè)定：以空白空調零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應在加終止液後15分鍾以内進行。
注意事項 ：
1． 試劑盒從(cóng)冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鍾後(hòu)方可使用 ，酶标包被闆開封後(hòu)如未用完 ，闆條應裝入密封袋中保存。
2． 濃洗滌(dí)液可能會(huì)有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌(dí)時不影響結果。
3． 各步加樣均應使用加樣器，並(bìng)經常校對其準確(què)性 ，以避免試驗誤差 。一次加樣時間控制在5分鍾内，如标本數量多 ，推薦使用排槍加樣 。
4． 請每次測(cè)定的同時做标準曲線，做複孔。如标本中待測(cè)物質含量過高（樣本OD值大於(yú)标準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）後再測(cè)定，計算時請zui後乘以總稀釋倍數（×n×5）。
5． 封闆(bǎn)膜隻(zhǐ)限一次性使用，以避免交叉污染 。
6． 底物請避光保存。
7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶标儀讀(dú)數爲準.
8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳(chuán)染物處(chù)理。
9． 本試(shì)劑(jì)不同批号組分不得混用。
10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)爲準。
計算 ：
以标準物的濃度爲橫坐标，OD值爲縱坐标，
在坐标紙上繪出标準曲線，根據樣品的OD
值由标準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋
倍數；或用标準物的濃度與OD值計算出标
準曲線的直線回歸方程式，将樣品的OD值
代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋
倍數，即爲樣品的實際濃度。
（此圖僅供參考）
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸(guī)與預期濃度相關(guān)系數R值爲0.95以上。
2.批内與批見(jiàn)應分别小於(yú)9%和11%
檢測範圍：
15ng/L -300ng/L
保存條件及有效期：
1.試(shì)劑(jì)盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個月
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