磷酸化蛋白11點經驗之談

實驗中磷酸化蛋白有哪些經(jīng)驗之談
，以下爲小編(biān)總結

1.  一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制劑，還(hái)要加入一定量的磷酸酶抑制劑，否則即使band壓出來也會(huì)很淺，結果也不可信。

2.  加一抗後4℃過一夜，保證抗體有充分的結合時間。因爲磷酸化的蛋白隻占總的蛋白量的極少部分。4℃也可使一抗重複(fù)使用多次。畢(bì)竟磷酸化的抗體都挺貴的。二抗則室溫1小時即可。

3.  磷酸化抗體的好壞是一個(gè)關鍵因素，所以要選擇好的廠(chǎng)商。

4.  根據(jù)廠(chǎng)商的protocol來操作實驗，這是實驗成功的保證。

5.  抗體的稀釋倍數也要适當(dāng)，不同廠(chǎng)商也會有不同要求。

6.  研究完某一蛋白的磷酸化情況後也要研究一下該(gāi)蛋白總的表達(dá)量。如壓完phospho-p38抗體後，把相同的membrane做strip後再壓p38，然後再strip一次，再壓内标actin。

7.  做磷酸化蛋白WB時，除瞭(le)目标蛋白的band以外，往往會出現非特異性的band。磷酸化抗體不好的話，甚至會壓出非特異性的band，而沒有你想要的band，所以壓片以後，你一定要根據markers比對一下，你壓出的band分子量是否正確(què)。

8.  磷酸化蛋白WB時backgroud也往往較深，所以壓片時間要适當(dāng)，不能太長(zhǎng)或過短，太長(zhǎng)則backgroud太深蓋住想要的那條band，時間過短則可能沒有band或者band太淺。

9.  磷酸化蛋白WB時，用TBST洗時也要注意一下，搖床的轉速不要太快，洗的時間不要太長(zhǎng)，孵育一抗和二抗之後分别洗5 min 3次即可，甯願background深一些，總比做不出來強得多。另外，洗的時候，不要把幾張membrane疊(dié)在一起洗。

10.  研究完某一蛋白的磷酸化情況後也要研究一下該(gāi)蛋白總的表達(dá)量。這有兩種方法，一是
：相同的sample在不同的well中上樣兩次（可在相同的 gel上，也可在不同的gel），其一壓磷酸化蛋白，另一壓該(gāi)蛋白總的表達(dá)量（包括磷酸化和未磷酸化的該(gāi)蛋白），甚至還可跑另一個gel，壓内标。但是不 建議如此做，因爲這樣比較時誤差還是較大的。

11.  Strip時一定要注意：membrane一定要*泡在strip solution中（可用較硬的塑料膜封好），然後(hòu)要*浸入水中，使受熱均勻。這一點(diǎn)很重要，要不然，随後(hòu)壓出來的總蛋白也好，内标也好就會不均一，無法進行比較。

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