Elisa方法中結合物的制備方法

Elisa方法中結合物的制備方法
上海恒遠生物實驗中心裏Elisa試劑盒結合物酶标記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯法和過碘酸鹽氧化法。首先跟随恒遠一起瞭解下戊二醛交聯法的制備辦法。

（1）戊二醛交聯法：戊二醛是一種雙功能團，它可以使酶與蛋白質的氨基通過它而聯結。堿性磷酸一般用此法進行标記。交聯方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中
，反應後即得酶标記抗體
。
ELISA中常用的酶一般都用此法交聯。它具有操作簡便、有效（結合率達60%-70%）和重複性好等優點。缺點是交聯反應是随機的，酶與抗體交聯時分子間的比例不嚴格，結合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯，影響效果。在兩步法中，先将酶與戊二醛作用，透析除去多餘的戊二醛後，再與抗體作用而形成酶标抗體。也可先将抗體與戊二醛作用，再與酶聯結。兩步法的産物中絕大部分的酶與蛋白質是以1:1的比例結合的，較一步法的酶結合物更有助於本底的改善以提高敏感度，但其偶聯的有效率較一步法低。
恒遠生物第二種制備方法爲

（2）過碘酸鹽氧化法：本法隻适用於含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的标記常用此法。反應時，過碘酸鈉将HRP分子表面的多糖氧化爲醛基很活潑，可與蛋白質上的氨基形成Schiff氏堿而結合。酶标記物按克分子比例聯結，其*比例爲：酶/抗體=1-2/1。此法簡便有效，一般認爲是HRPzui可取的标記方法，但也有人認爲所有較爲強烈，各批實驗結果不易重演。 
按以上方法制備的酶結合物一般都混有未結合物的酶和抗體。理論上
，結合物中混有的遊離酶一般不影響ELISA中zui後的酶活性測定，因經過*洗滌，遊離酶可被除去
，並不影響zui終的顯色。但遊離的抗體則不同，它會與酶标抗體競争相應的固相抗原，從而減少瞭結合到固相上的酶标抗體的量。因此制備的酶結合物應予純化，去除遊離的酶和抗體後用於檢測，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應用。硫酸铵鹽析法zui爲簡便，但效果並不理想，因爲此法隻能去除留在上清中的遊離酶，但相當數量的遊離抗體仍與酶結合物一起沉澱而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更爲可取，液相層析法可将制備的結合物清晰地分成三個部分：遊離酶
、遊離抗體和純結合物而取得*的分離效果，但費用較貴。
結合物制得後，在用作ELISA前尚需確定其适當的工作濃度。使用過濃的結合物，既不經濟，又可使本底增高；結合物的濃度過低，則又影響檢測的敏感性。所以必須對結合物的濃度予以選擇。zui适的工作濃度就是指結合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，並獲得測定的*靈敏度，達到zui合适的測定條件和測定費用的節省。就酶标抗體本身而言，它的有效工作濃度是指與其相應抗原包被的載體作試驗時，能得到陽性反應的zui高稀釋度。例如某一HRP：抗人IgG制劑标明的工作濃度爲1:5000，表示該制劑經1:5000稀釋後，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗時，将發生陽性反應。但在用於具體的ELISA檢測中，酶标抗體的zui适工作濃度受到固相載體的性質、包被抗原或抗體的純度以及整個檢測系統如标本、反應溫度和時間等的影響，因此必須在實際測定條件下進行\"滴配\"選擇能達到高敏感度的zui大稀釋度作爲盒中的工作濃度。

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