蛋白質免疫印迹法實驗操作

Western Blot印迹技術 根據(jù)上海恒遠瞭(le)解。1975，Edwen Southern提出分子印迹概念。 概念：将存在於(yú)凝膠中的生物大分子轉移（印迹）於(yú)固定化介質上並(bìng)加以檢測分析的技術。目前主要應用於(yú)DNA,RNA，蛋白質的檢測。 蛋白質免疫印迹法 免疫印迹法 (Western blotting) 是一種(zhǒng)将高分辨率凝膠電泳和免疫化學分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特異性強等優點 ，是檢測(cè)蛋白質特性、表達(dá)與分布的一種zui常用的方法，如組織抗原的定性定量檢測(cè)、多肽分子的質量測(cè)定及病毒的抗體或抗原檢測(cè)等。 免疫印迹法(immunobiotting test,IBT)亦稱(chēng)酶聯免疫電轉移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB),因與Southern早先建立的檢測(cè)核酸的印迹方法 Southern blot 相類(lèi)似，亦被稱(chēng)爲Western-blot. 應用 1 檢(jiǎn)測(cè)樣品中特異蛋白存在與否 2 細(xì)胞中特異(yì)蛋白的半定量分析 3 蛋白質(zhì)分子相互作用的研究 試劑準備 1、SDS-PAGE試劑(jì)：見電(diàn)泳實驗。 2、勻漿緩(huǎn)沖(chōng)液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。 3、轉膜緩(huǎn)沖(chōng)液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。 4、0.01M PBS(pH7.4）：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。 5、膜染色液：考馬斯亮蘭(lán) 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉，現配）：脫脂奶粉1.0g 溶於(yú)20ml的0.01M PBS中。 6、顯(xiǎn)色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸鎳(niè)胺 0.1ml；H202 1.0μl。 操作步驟 一蛋白質樣品獲得：細菌誘導表達(dá)後 ，可通過電泳上樣緩沖(chōng)液直接裂解細胞，真核細胞加勻漿緩沖(chōng)液，機械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然後4℃，13,000g離心15min。取上清液作爲樣品。 二電(diàn)泳：制備(bèi)電(diàn)泳凝膠，進行SDS-PAGE。 三轉移：（半幹式轉移） 1、電(diàn)泳結束後将膠條割至合适大小，用轉膜緩沖(chōng)液平衡，5min×3次。 2、膜處(chù)理：預先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉膜緩沖(chōng)液中10min。 3、轉膜：轉膜裝置從下至上依次按陽極碳闆、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳闆的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜對齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，将碳闆上多餘的液體吸幹。接通電源，恒流1mA/cm2，轉移1.5hr。轉移結束後，斷開電源将膜取出，割取待測(cè)膜條做免疫印迹。将有蛋白标準的條帶染色，放入膜染色液中50s後，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然後用雙蒸水洗，風幹夾於(yú)兩層濾紙中保存，留與顯色結果作對比。 四免疫反應： 1、用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。 2、加入包被液，平穩搖動(dòng)，室溫(wēn)2hr。 3、棄(qì)包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。 4、加入一抗（按合适稀釋比例用0.01M PBS稀釋，液體必須覆蓋(gài)膜的全部），4℃ 放置12hr以上。陰性對(duì)照，以1%BSA取代一抗，其餘步驟與實驗組相同。 5、棄(qì)一抗和1%BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min×4次。 6、加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯的二抗（按合适稀釋比例用0.01M PBS稀釋），平穩搖動(dòng)，室溫2hr。 7、棄(qì)二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。 8、加入顯色液，避光顯色至出現條帶(dài)時(shí)放入雙蒸水中終止反應。 實驗操作 1 細胞裂解物的準備； 2 細(xì)胞裂解物的蛋白定量； 3 細(xì)胞裂解物的SDS-PAGE； 4 蛋白質的轉移； 6 目的蛋白質的檢測。 免疫印迹隻能檢測(cè)目的蛋白的相對(duì)含量 測(cè)定相對含量時，需要内參(cān)照 選擇合适的反應條件：SDS-PAGE膠(jiāo)濃度；轉移膜的選擇；轉移時間(jiān)的選擇 注意電極的正負極 抗體反應時，注意驅(qū)除反應袋内氣(qì)泡 操作要輕柔。