Western Blot技術服務Western Blot。它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著(zhe)色。通過分析著(zhe)色的位置和著(zhe)色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中的表達情況的信息 。我司本周展示WB實驗具體操作步驟。歡迎聚焦賞析，您可将您的建議或意見告知我們，真誠(chéng)爲您服務 ，上海恒遠生物歡迎您的光臨。
因上海恒遠WB實(shí)驗爲代測(cè)服務。我司服務流程如下：
1.客戶(hù)提供一抗，是進口的抗體，本公司可代購(gòu)
2.提取樣(yàng)本總蛋白，進(jìn)行總蛋白定量
3.根據總蛋白定量的結果，微調(diào)各個樣本間濃度差異，高溫變(biàn)性，加入loading buffer，上樣跑膠，以及轉膜顯色等步驟
4.利用軟件對所得膠片進行掃描，用相對定量方法進行定量分析時 ，要對管家蛋白等參(cān)比蛋白進行同樣操作，用所得到的值進行蛋白量的校正 ，zui後求得目的蛋白的相對表達(dá)量
5.提供實驗報(bào)告：包括詳細的實驗方法及western blot結果的相關圖表 。以下爲我司具體做實驗的操作步驟，歡迎點(diǎn)擊閱讀：
【操作步驟】
1）按廠商的使用指南用兩塊幹淨的玻璃，平闆和0.75mm墊片組裝電泳裝置中的玻璃平闆夾層，並固定在灌膠支架上。
2）按表1配制分離膠液體並脫氣，然後加入10％的過硫酸铵和TEMED，輕輕攪拌混勻。
表1 聚丙烯酰胺分離膠的配制
試劑成分配制不同濃度分離膠所需試劑（ml）
5%8%10%12%15%
Acry:Bis （30:0.8）2.504.005.006.007.50
4×Tris?Cl/SDS, pH8.83.753.753.753.75
H2O8.757.256.255.253.25
10%過硫酸铵0.050.050.050.050.05
TEMED0.010.010.010.010.01
按所需分離的蛋白質分子大小選擇合适的丙烯酰胺百分比濃度，一般地，5％的凝膠可用於60～200kDa的SDS變性蛋白質分子的分離，10％用於16～70kDa，15％用於12～45kDa。
3）用一根巴斯德吸管立即将分離膠液體沿夾層中一條墊片的邊緣加入於玻璃平闆夾層中，至凝膠約5cm高爲止。樣品體積少於10μl不需灌制積層膠。
4）用另一根已斯德吸管，先從一邊的墊片，再從另一邊墊片往夾層的液面頂部緩緩加入一層水飽和異丁醇（厚約1cm）。讓凝膠在室溫聚合30min。
聚合後，可見在頂層異丁醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線，膠的聚合失敗往往問題在於過硫酸按或TEMED，或兩者都有 。
5）傾去頂層的異丁醇，並以1×Tris-Cl/SDS, pH8.8緩沖液沖洗凝膠的頂部表面,盡量用吸水紙吸幹。
6）按表2配制積層膠液體，用吸管将液體沿一條墊片加入到玻璃平闆夾層，直至夾層的頂部。
表2 聚丙烯酰胺積層膠的配制
GEL%（3.9%） Total （10.05ml）
Acry:Bis（30:0.8） 1.30 ml
4×Tris?Cl/SDS, pH6.8 2.50 ml
H2O 6.10 ml
10%過硫酸铵 0.05 ml
TEMED 0.01 ml
7）将0.75mm厚的梳子插入夾層的積層膠液體中，必要時，再補加積層膠液體充盈剩餘空間。讓積層膠室溫聚合30min。
8）在具螺口蓋的微量離心管中，用2×SDS加樣緩沖液按1:1（v/v）稀釋待測蛋白質樣品，於100℃煮沸5-10min。如樣品是蛋白質沉澱物，加入50～100μl 1×SDS加樣緩沖液溶解之 ，並同樣在100℃煮沸5-10min。按供應商的使用指南用2×SDS加樣緩沖液溶解蛋白質分子量标準混合物 。
對於0.3cm寬的加樣孔，推薦加樣體積以不超過20μl 爲宜。用考馬斯亮藍染色法顯迹，成分很複雜的蛋白質混合物需加25～50μg，而樣品中隻有一種或不多的幾種蛋白的話 ，隻需1～10μg蛋白量。採用銀染顯迹時，樣品用量可減小10～100倍（按樣品的複雜程度在小於20μl的體積溶有0.01～0.5ng蛋白樣品不等）。
2×SDS加樣緩沖液（loading buffer）配制 ：
成分 體積 （ml）
0.5M Tris?Cl （pH6.8） 12.5
20%SDS 11.5
Glycerin 10
2% Blue-Bromo-phenol 2.5
β-mercaptoethanol * 5.0
加H2O至總體積50 ml，分裝
*β-mercaptoethanol 在臨用前加入。
9）小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝膠加樣孔。取出梳子後 ，以1×SDS電泳電泳緩沖液沖洗加祥孔，並以此緩沖液充滿之 。
10）按廠商指南将凝膠闆固定到電泳裝置的上緩沖液室（上槽），同時往下緩沖液室（下槽）加入推薦量的1×SDS電泳緩沖液。
11）将固定於上槽的凝膠闆放入下槽中，並往上槽加入部分電泳緩沖液至剛好淹沒凝膠的加樣孔 。
12）用帶平嘴針頭的50μl注射器将同樣濃度的蛋白質樣品等體積加入到樣品孔中，小心加樣使樣品在孔的底部成一薄層 ，對照孔加入蛋白質分子量标準樣品，如有空置的加樣孔，須加等體積的空白1×SDS樣品緩沖液，以防相鄰泳道樣品的擴散 。
13）再往上槽加入餘下的1×SDS電泳緩沖液。此操作緩慢小心，以防沖起樣品孔中的樣品。
14）連接電源 ，對於0.75mm厚的垂直闆電泳 ，先在60V下電泳至溴酚藍染料從積層膠進入分離膠，再将電壓調至120V繼續電泳至溴酚藍到達凝膠底部爲止。
15）關閉電源並撤去連接的導線，棄去電泳緩沖液。連同上槽一起将凝膠夾層取出。
16）将凝膠定位以便識别加樣的順序，将凝膠闆從上槽解離出來，放在一疊吸水紙或紙巾上 。
17）小心将封邊的墊片抽出一半，並以此爲杠杆橇起上面的玻璃平闆，使凝膠暴露出來。
18）小心從下面的玻璃平闆上移出凝膠，在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及幹膠後仍能認出加樣次序，接著就可進行蛋白質的檢測。
19）轉膜 ：将凝膠面與負極相連，硝酸纖維素膜與正極相連 。（100V，1小時）要放於4℃。
20）清洗：将硝酸纖維素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分鍾。搖床搖動。
21）封閉
22）一抗孵育：一抗用TBST1:1000稀釋，将硝酸纖維素膜放入其中，37℃孵育1.5小時，（或4℃過一夜）搖床搖動。
23）清洗：将硝酸纖維素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分鍾。
24）二抗孵育：二抗用TBST1:8000稀釋，将硝酸纖維素膜放入其中，37℃孵育1小時，搖床搖動。
25）清洗：同22，之後，用1X TBS在清洗2次，每次5分鍾，以洗去膜上的Tween 20，因爲它可以阻礙底物的沉積。
26）顯色
按如下配方配制顯色液：
1mL水+1滴（大約50微升）試劑A（之後混勻）+1滴試劑B+1滴試劑C
将硝酸纖維素膜放入其中孵育，一旦顯色，立即放入去離子水中終止反應。
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