本章解析：ELISA系統穩定實驗更真實可靠

本章解析：ELISA系統穩定實驗更真實可靠

ELISA檢測系統可謂是免疫學反應應用到科研生産中zui爲靈敏的技術手段。可是在新老手操作過程中總是會出現或大或小的問題，本人在剛開始做ELISA時就面臨很多困難，雖然有師兄師姐鋪路，但還是常常做得一塌糊塗，比如說花闆，假陽性，全顯色，全部顯色，顯色比空白還低。。。。。。自己也爲此苦惱過很長一段時間，随著(zhe)自己技術水平得提高，或多或少地也掌握瞭(le)ELISA體系的脾氣，也是熟能生巧吧，現在做方陣，做ELISA已是輕車熟路瞭(le)，以前檢測一種抗體用整整一下午還算得暈暈的，現在給我十個八個的從包被到顯色，一個工作日基本搞定
。下面就由我抛磚引玉地來說一下，做ELISA的經驗總結:

1、包被原的性質很重要，蛋白濃度，是否降解，這關系到你做出的抗體可不可以被其識别，所以保存抗原很重要，我做重組蛋白時，師兄都嚴格警告我一定要在冰浴下緩慢融化就是這個道理
。還有有的包被原可能不是蛋白，對於(yú)生物素和脂類物質或小分子物質我們要事先對其改造再加以包被，我把方法簡要的列出如下:①親和素生物素:先親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用於(yú)各種抗原物質的定量測(cè)定。②脂類物質:可将其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解後加入ELISA闆孔中，開蓋置冰箱過一夜或冷風吹幹，待酒精揮發後，讓脂質自然幹固在固相表面
。③小分子必須依靠和大的蛋白載體偶聯後才能固定在固相載體上。

2、包被液的選擇，一般選擇ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時由於(yú)試驗的需要
，包被原的特殊性也可能採用中性的緩沖溶液來包。應注意以下原理：由於(yú)蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用，這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響，大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團
，故更易吸附到固相載體表面。具體的試驗還要有堅固的理論外也要實踐，看一下zui終可不可以應用到自己試驗當中去。常用的包被液除瞭(le)剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。

3、封閉(bì)：繼包被之後用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。封閉(bì)就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥ELISA後的步驟中幹擾物質的再吸附。常用封閉(bì)劑有：0.05%-0.5%的BSA；10%的小牛血清或1%明膠；脫脂奶粉，比較價廉，可以高濃度使用（5%－10％）；還有一些稀有用到的各種動物血清（主要爲瞭(le)排除相似蛋白幹擾）和酪蛋白等等。但zui終選用什麽，要依據試驗具體來實踐。

4、洗滌闆：可以說在ELISA操作中，洗滌是zui主要的關鍵技術。因爲聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，爲達到分離遊離的和結合的酶标記物的目的，清除殘(cán)留在闆孔中遊離的物質，以及非特異性地吸附的幹擾物質，在洗滌時又應把這種非特異性吸附的幹擾物質洗滌下來。所以在洗闆時會有一定誤差，人爲因素很大（當然有條件的用洗闆機除外），洗的不*或串瞭(le)孔，對如此靈敏的ELISA系統可是不小的影響。

5、加抗體标本(和二抗):注意該換槍頭時換槍頭。标本稀釋一般可用pbs稀釋，也可用封閉(bì)液去稀釋。如需加二抗，還要注意二抗的工作濃度，太高浪費，太低則著(zhe)色淺。

6、顯色:顯色系統又很多，我們一開始做的時候，要選擇适宜的顯色系統。注意顯色系統酶活性底物的保存HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊(dié)氮鈉。

7、每次做盡量要把陰陽空三個(gè)對(duì)照做好，如出現問題也好分析。