兔前列腺素E2試劑盒說明書詳解

兔前列腺素E2(PGE2)酶聯免疫分析（ELISA）

試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用       目的：本試劑盒用於(yú)測(cè)定兔血清，血漿及相關液體樣本中前列腺素E2(PGE2)的含量。

實驗原理：

   本試劑(jì)盒應用雙抗體夾心法測(cè)定标本中兔前列腺素E2(PGE2)水平。用純化的抗-PGE2抗體(tǐ)包被微孔闆，制成固相抗體(tǐ)，往包被單(dān)抗的微孔中依次加入前列腺素E2(PGE2)，再與HRP标記的PGE2抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶标抗體複(fù)合物，經過*洗滌後加底物TMB顯(xiǎn)色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，並(bìng)在酸的作用下轉化成zui終的黃(huáng)色。顔色的深淺和樣品中的前列腺素E2(PGE2)呈正相關。用酶标儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過标準曲線計算樣品中兔前列腺素E2(PGE2)濃度。

試劑盒組成：

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鍾，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過(guò)程中如出現沉澱(diàn)，應再次離心。

2. 血漿：應根據标本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作爲抗凝劑，混合10-20分鍾後，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱(diàn)形成，應該(gāi)再次離心。

3. 尿液：用無菌管收集
，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱(diàn)形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參(cān)照實行。

4. 細胞培養上清：檢測(cè)分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測(cè)細胞内的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右
。通過反複凍融，以使細胞破壞並(bìng)放出細胞内成份。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉澱形成，應再次離心。

5. 組織标本：切割标本後，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備(bèi)用。标本融化後仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器将标本勻漿充分。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝後一份待檢測(cè)，其餘冷凍備(bèi)用。

6. 标本採(cǎi)集後盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取後應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可将标本放於-20℃保存，但應避免反複凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1. 标準品的稀釋(shì)與加樣：在酶标包被闆上設(shè)标準品孔10孔，在*、第二孔中分别加标準品100μl，然後(hòu)在*、第二孔中加标準品稀釋(shì)液50μl，混勻；然後(hòu)從(cóng)*孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标準(zhǔn)品稀釋(shì)液50μl，混勻(yún)；然後(hòu)在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中
，再在第五、第六孔中分别加标準品稀釋液50ul，混勻；混勻後(hòu)從(cóng)第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中
，再在第七、第八孔中分别加标準(zhǔn)品稀釋(shì)液50μl，混勻後(hòu)從(cóng)第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标準(zhǔn)品稀釋(shì)液50μl，混勻後(hòu)從(cóng)第九第十孔中各取50μl棄(qì)掉。（稀釋後(hòu)各孔加樣量都爲50μl，濃度分别爲480ng/L ，320ng/L，160ng/L，80ng/L， 40ng/L）。

2. 加樣：分别設空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶标試劑(jì)，其餘各步操作相同）、待測樣品孔。在酶标包被闆上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋(shì)液40μl，然後再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋(shì)度爲(wèi)5倍）。加樣将樣品加於(yú)酶标闆孔底部，盡量不觸(chù)及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 溫(wēn)育：用封闆膜封闆後(hòu)置37℃溫育30分鍾。

4. 配液：将20倍濃縮洗滌(dí)液用蒸餾水20倍稀釋後備(bèi)用。

5. 洗滌(dí)：小心揭掉封闆膜，棄(qì)去液體，甩幹，每孔加滿洗滌(dí)液，靜置30秒後棄去
，如此重複(fù)5次，拍幹。

6. 加酶：每孔加入酶标試(shì)劑(jì)50μl，空白孔除外。

7. 溫育：操作同3。

8. 洗滌：操作同5。

9. 顯(xiǎn)色：每孔先加入顯(xiǎn)色劑(jì)A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鍾. 

10. 終止：每孔加終止液50μl，終(zhōng)止反應(yīng)（此時藍色立轉黃色）。

11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應在加終止液後(hòu)15分鍾以内進行。

注意事項：

1． 試劑盒從(cóng)冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鍾後(hòu)方可使用
，酶标包被闆開封後(hòu)如未用完，闆條應裝入密封袋中保存。

2． 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋(shì)時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

3． 各步加樣均應使用加樣器，並(bìng)經常校對其準確(què)性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鍾内，如标本數量多，推薦使用排槍加樣。

4． 請每次測(cè)定的同時做标準曲線，做複孔。如标本中待測(cè)物質含量過高（樣本OD值大於(yú)标準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）後再測(cè)定，計算時請zui後乘以總稀釋倍數（×n×5）。

5． 封闆(bǎn)膜隻(zhǐ)限一次性使用，以避免交叉污染。

6． 底物請避光保存。

7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶标儀讀(dú)數爲準.

8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳(chuán)染物處(chù)理。

9． 本試(shì)劑(jì)不同批号組分不得混用。

10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)爲準。