人PR免疫組化試劑盒實驗說明書

                           人PR免疫組化試劑盒
該試劑盒以HRP 标記的鏈黴親和素複合物（HRP Streptavidin Conjugate，HRP-SA）爲基礎
，可用於檢測細胞、組織内的特異性PR 抗原。該試劑盒具有靈敏度高、特異性強、定性定位準確、背景清晰。在所用的PR 一抗與相應靶抗原結合後
，用生物化二抗與一抗特異性結合，zui後加入HRP-SA，形成抗原—特異一抗—生物素化二抗—HRP-SA 複合物，顯微鏡下觀察成像。
試劑盒所含試劑：
試劑A 通透液
：0.1% Triton-X 100 10 mL（選用）
試劑B 封閉緩沖液（封閉用） 20 mL
試劑C （*分裝）已稀釋的即用型PR 一抗（2.5ml）
試劑D （*分裝）生物素化羊抗兔IgG 1 支
（濃度1.5 mg/mL，稀釋比爲1:300~1:500）50 μL+抗體稀釋液20ml試劑E HRP-SA 複合物1 支（濃度1 μM，稀釋比1:50~1:200）100 μL試劑F DAB 顯色液 5ml
用戶自備試劑：
1． 10mM TBS（pH7.2~7.4）
三羟基氨基甲烷1.21g
氯化鈉7.6g
加蒸餾水800mL，濃鹽酸調pH 值至7.2~7.4，zui後定容至1000mLTBS-T：TBS+Tween 20（0.05%體積比）
2．抗原修複液（依檢測抗原不同而選擇不同的修複液）10mM pH6.0 檸檬酸緩沖液
檸檬酸0.38g
檸檬酸三鈉2.45g
加蒸餾水900mL，濃鹽酸調pH 值至6.0，zui後定容至1000mL
或：0.5M EDTA 修複液（pH8.0）
EDTA·2H2O 186.1g
檸檬酸三鈉2.45g
加蒸餾水700mL，用10mM NaOH 調pH 值至8.0，zui後定容至1000Ml
3. 緩沖甘油封固劑10 mL
4. Tween 20 5 mL
石蠟包埋組織切片免疫染色
實驗步驟（建議方案）：
石蠟包埋組織切片3~4μm 厚度
1.烤片： 将待做切片置於切片架上，於60℃恒溫烤箱中至少烤1 hr；
2.脫蠟： 切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟3 次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10 min；
3.水化： 切片經下行酒精水化，無水乙醇5min，95%乙醇2 次（每次2min），85%乙醇2 min；75%乙醇2min，自來水沖洗，ddH2O 洗2×2min；
4.抗原修複： 根據抗體說明書推薦方法進行抗原修複，常採用高壓
、微波（溫度達到98~100℃）或酶消化修複法，室溫自然冷卻，自來水沖洗，ddH2O 洗2×2min，TBS 洗滌（2×2min）（具體修複方法見附1）* 注
：有些抗原勿需修複，直接進入第5 步封閉。
5.封閉： 滴加試劑B，37℃濕盒孵育30 min；
6.加一抗：滴加用試劑C（即用型一抗），37℃濕盒孵育2 hr 或4℃過一夜；
7.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min）；
8.封閉
： 滴加試劑B，37℃濕盒孵育10 min；
9.加二抗： 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗（試劑D），37℃濕盒中孵育30 min；
10.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min）；
11.封閉
： 滴加試劑Tween 20，37℃濕盒孵育封閉20 min；
12.加HRP-SA： 滴加用抗體稀釋液稀釋的試劑E（1：50~200，終濃度5~20 nM），37℃濕盒中孵育30 min；
13.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min），TBS 洗滌（2×5 min）；
14.顯色：應用DAB 溶液（試劑F）顯色；
15.複染：自來水充分沖洗，複染，脫水，透明；
16.封片： 待組織标本幹後
，用試劑緩沖甘油封固劑封片；
17.觀察成像： 顯微鏡下觀察成像。
注意事項：
1. 修複後緩沖液須自然冷卻，自來水沖洗後方能把切片取出，驟冷有可能導緻結晶或抗原封閉。
2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反複使用。
3. 若試劑爲微量濃縮液，用前應低速離心，将内蓋和管壁附著的溶液離到底部。
4. 封片前一定要換用TBS 充分洗滌，以便洗去組織上殘留的Tween 20，否則會影響結果觀察。
5. 如須複染細胞核，則在封片前複染或直接採用含有染核試劑的封片劑進行封片。
附1：
抗原修複方法
常用抗原修複液：檸檬酸緩沖液（0.01M pH6.0）、EDTA 抗原修複液（pH8.0 或9.0）等等。
一、酶消化修複法
切片脫蠟水化處理，TBS 沖洗，在組織上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶，37℃孵育20~30min 後TBS 沖洗即可。
二、微波抗原修複法
微波盒中加入抗原修複液微波加熱至沸騰，将脫蠟水化後的切片置於耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔或繼續微波10~15min，取出微波盒冷卻至室溫後，自來水沖洗，取出切片。因不同微波爐微波處理時間存在差異，須自行調整。
三、直接高壓抗原修複法
取修複液於不鏽鋼高壓鍋中加熱至沸騰，将組織切片置於耐高溫切片架上，修複液沸騰後放入切片架，蓋上鍋蓋，待噴氣後計時1.5~2.5min 即可脫離熱源，自然冷卻至室溫後自來水沖洗，取出切片。此方法适用於較難檢測或核抗原的修複。
四、隔水式高壓抗原修複法
不鏽鋼高壓鍋中加自來水加熱至沸騰，微波盒中加入修複液於微波爐中加熱至沸騰，将切片放入微波盒中
，再将微波盒放入高壓鍋中蓋上鍋蓋，待噴氣後計時4~8 min 即可關閉熱源，自然冷卻至室溫後自來水沖洗，取出切片。此方法适用於較難檢測或核抗原的修複。