，保存過程中如有沉澱形成，應該再次離心。 3.尿液 ：用無菌管收集 ，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱形成 ，應再次離心 。胸腹水、腦脊液參照實行 。 4.細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞内的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右 。通過反複凍融，以使細胞破壞並放出細胞内成份。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉澱形成 ，應再次離心。 5.組織标本：切割标本後，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。标本融化後仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器将标本勻漿充分 。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝後一份待檢測 ，其餘冷凍備用 。 6. 标本採集後盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取後應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗 ，可将标本放於-20℃保存，但應避免反複凍融. 7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。 操作步驟 1. 标準品的稀釋與加樣：在酶标包被闆上設标準品孔10孔，在*、第二孔中分别加标準品100μl，然後在*、第二孔中加标準品稀釋液50μl，混勻；然後從*孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔 ，再在第三 、第四孔分别加标準品稀釋液50μl，混勻；然後在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中 ，再在第五、第六孔中分别加标準品稀釋液50ul，混勻；混勻後從第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标準品稀釋液50μl，混勻後從第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中 ，再在第九第十孔分别加标準品稀釋液50μl，混勻後從第九第十孔中各取50μl棄掉 。（稀釋後各孔加樣量都爲50μl，濃度分别爲360 μg/ml，240μg/ml ，120μg/ml，60μg/ml， 30μg/ml）。 2. 加樣：分别設空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶标試劑(jì)，其餘各步操作相同）、待測樣品孔。在酶标包被闆上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然後再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度爲5倍）。加樣将樣品加於(yú)酶标闆孔底部 ，盡量不觸(chù)及孔壁，輕輕晃動混勻。 3. 溫育：用封闆膜封闆後置37℃溫育30分鍾。 4. 配液：将20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋後備用。 5. 洗滌(dí) ：小心揭掉封闆膜，棄(qì)去液體，甩幹，每孔加滿洗滌液，靜置30秒後棄去，如此重複5次，拍幹。 6. 加酶 ：每孔加入酶标試劑50μl，空白孔除外。 7. 溫育：操作同3。 8. 洗滌：操作同5。 9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鍾. 10. 終止 ：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。 11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液後15分鍾以内進行 。 注意事項： 1． 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鍾後方可使用 ，酶标包被闆開封後如未用完 ，闆條應裝入密封袋中保存。 2． 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋(shì)時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果 。 3． 各步加樣均應使用加樣器，並經常校對其準確性 ，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鍾内，如标本數量多，推薦使用排槍加樣。 4． 請每次測定的同時做标準曲線，做複孔。如标本中待測物質含量過高（樣本OD值大於标準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）後再測定 ，計算時請zui後乘以總稀釋倍數（×n×5）。 5． 封闆(bǎn)膜隻(zhǐ)限一次性使用，以避免交叉污染。 6． 底物請避光保存 。 7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶标儀讀數爲準. 8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳(chuán)染物處(chù)理。 9． 本試(shì)劑(jì)不同批号組分不得混用。 10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)爲準。  計算：
以标準物的濃度爲橫坐标 ，OD值爲縱坐标 ， 在坐标紙上繪出标準曲線，根據樣品的OD 值由标準曲線(xiàn)查出相應的濃(nóng)度；再乘以稀釋(shì) 倍數；或用标準物的濃度與OD值計算出标 準曲線的直線回歸方程式 ，将樣品的OD值 代入方程式，計(jì)算出樣品濃(nóng)度，再乘以稀釋(shì) 倍數，即爲樣品的實際濃度。 （此圖僅供參考） 試劑盒性能： 1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值爲0.990以上。 2.批内與批見應分别小於9%和11% 保存條件及有效期： 1.試劑盒保存：；2-8℃。 2．有效期：6個月 |
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